Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie In vitro

Het algemene doel van deze procedure is om primaire postnatale neuroblasten van knaagdieren te transfecteren om het effect van doeleiwitten op hun migratie te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst de neuroblasten uit de rostrale migratiestroom van de knaagdieren te dissecteren. De tweede stap is om ze te dissociëren en vervolgens te transfecteren door nucleaire affectie met ofwel DNA ofwel S-H-R-N-A.

Vervolgens worden de neuroblasten opnieuw geaggregeerd in hangende druppels en vervolgens gedurende een geschikte tijd in suspensie gekweekt. De laatste stap is om de geaggregeerd neuroblastenclusters in een driedimensionale matrix in te bedden en ze te laten migreren. Uiteindelijk wordt immunofluorescentie of time-lapse beeldvormingsmicroscopie gebruikt om de migratie van neuroblasten te analyseren.

Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in het neurogeneseveld te beantwoorden, zoals de controle van de migratie van neuroblasten afgeleid van stamcellen in de postnatale hersenen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig en snel is in vergelijking met het gebruik van virale vectoren, wat uitdagend en tijdrovend kan zijn. Na het opofferen van een P zes tot P zeven rattenkudde, maak een anterieure incisie in de huid langs de middelste sagittale sutuur van de neus tot het cerebellum met een scalpelblad op elke rat.

Vervolgens wordt de huid eraf gepeld. Herhaal dezelfde incisie langs de schedel. Verwijder vervolgens voorzichtig de cranale flappen met een pincet en verwijder voorzichtig de hersenen samen met de reukbollen met een spatel.

Daarna snijdt u het meest coddle derde deel van de hersenen af en gooit het weg. Snijd vervolgens het hersenweefsel in 1,4 millimeter dikke coronale plakjes met behulp van een weefselkapper. Breng de plakjes over in een schaal met koud dissectiemedium.

Bekijk vervolgens de plakjes onder de dissectiemicroscoop. Scheid ze voorzichtig met behulp van een naald. De rostrale migratiestroom verschijnt als een driehoekige doorschijnende zone in het centrum van de OB-secties en als een kleine cirkelvormige zone.

In meer coddle hersensneden snijdt u de RMS uit elke snede met een microchirurgisch mes en zorg ervoor dat u omliggend weefsel niet opneemt. Verzamel vervolgens de RMS-fragmenten met een plastic pasterpipet en plaats ze in een kleine schaal met koud dissectiemedium op ijs. Draai vervolgens voorzichtig de schaal om de RMS-fragmenten in het midden van de schaal te verzamelen.

Verzamel de fragmenten met een plastic pipet en breng ze over in een 15 milliliterbuis. Laat de fragmenten op de bodem van de buis bezinken. Vervang het dissectiemedium door twee milliliter dissociatiemedium T tri.

Beoordeel de RMS-fragmenten door de fragmentensuspensie voorzichtig op en neer te pipetten ongeveer 10 keer met behulp van een P 1000 pipet daarna. Laat de buis met de weefselfragmenten gedurende twee minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Pipetteer vervolgens de oplossing weer 10 keer en zorg ervoor dat de fragmenten zijn gedissocieerd.

Deactiveer vervolgens het trypsine door vijf milliliter voorverwarmd DMEM plus 10%FCS toe te voegen en centrifugeer de celsuspensie bij 433 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder het overtollige medium en resus. Suspendeer de celpellet door het voorzichtig in een milliliter voorverwarmd DMEM plus 10%FCS te pipetten en voeg vervolgens nog eens vier milliliter van hetzelfde medium toe.

Voer vervolgens een celtelling uit. Een minimum van 2,5 keer 10 tot de zesde cel is vereist voor elke nucleaire affectie, terwijl optimale resultaten worden bereikt. Gebruik drie tot vier keer 10 tot de zesde cel per nucleaire affectie.

Centrifugeer de celsuspensie bij 433 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder daarna zoveel mogelijk medium in deze procedure. Resus onmiddellijk, suspendeer de celpellet in de nucleaire affectielaas voor rattenneuronen die eerder is geïncubeerd.

Bij kamertemperatuur brengt u 100 microliter van de celsuspensie over naar elke EOR-buis die SI R-N-A-D-N-A bevat. Meng het vervolgens voorzichtig door twee tot drie keer te pipetten met een P 200 pipet. Voeg vervolgens het monster toe aan de bodem van de nucleaire affectievat, waarbij u ervoor zorgt geen luchtbellen te genereren.

Gebruik voor nucleaire affectie programma G dash 0 1 3 voor rattencellen of O dash 0 0 5 voor muiscellen. Voeg vervolgens snel een milliliter voorverwarmd DMEM plus 10%FCS toe aan het nucleair beïnvloede monster. Breng het monster over naar een 15 milliliterbuis met vijf milliliter voorverwarmd DMEM plus 10%FCS met behulp van de plastic pipet die wordt geleverd met het nucleaire affectiekit.

Centrifugeer vervolgens het monster bij 433 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig al het overtollige medium en suspendeer de pellet in 25 tot 30 microliter voorverwarmd DMEM plus 10%FCS met behulp van een P 20 pipet. Gebruik niet meer dan 30 microliter medium.

Pipet de suspensie vervolgens als een druppel op de binnenkant van het deksel van een P 35-schaal. Draai vervolgens het deksel om over de P 35-schaal met twee milliliter compleet medium. Laat het minimaal vijf uur in de incubator op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide staan.

Na vijf uur brengt u de hangende druppels van het deksel over in het compleet medium in de schaal. Gebruik een P 1000 pipet met een gesneden punt. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide voor DNA NU-nucleaire infecties of 48 uur voor SI A HRA-nucleaire affecties.

Bereid nu 25 milliliter compleet medium voor en breng het in evenwicht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende een paar uur. Haal ondertussen de bevroren aliquoten van de basaalmembraanmatrix uit de vriezer van min 80 graden Celsius en laat ze ontdooien op ijs in de koude ruimte. Bereid voor elke nucleaire affectie een