Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry
13 december 2013
Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.
Deze procedure gebruikt muisretinaweefsel om te demonstreren hoe kwetsbaar neuraal weefsel kan worden gestabiliseerd om de structurele integriteit te behouden. Tijdens verschillende stappen van immunohistochemisch kleuren, nucleeer eerst het oog, verwijder de hoornhuid en scheid de retina van de sclera. Maak insnijdingen in de retinale oogcup om het weefsel plat te maken.
Bevestig vervolgens de retina aan een versterkte ringmembraan met behulp van een zuigtransfer zonder directe manipulatie om de integriteit van het weefsel te behouden. Breng nu de ring over naar een multi-well plaat voor kleuring. Onze resultaten tonen aan dat deze techniek effectief kan worden gebruikt in levend weefsel en biedt een superieur substraat voor de beeldvorming van synaptische eiwitten in vergelijking met bestaande metalen voor het hanteren van gedissecteerde retina.
Deze technieken maken de overdracht van delicaat weefsel mogelijk met minimale fysieke manipulatie. Dit zal de kans op vervorming en schade verminderen. We hadden dit idee voor het eerst toen we moesten opnemen van plat gemonteerd weefsel in RD een muis, een model van retinale degeneratie, en deze muisretina zijn extreem dun en kwetsbaar vanwege uitgebreide celverlies veroorzaakt door de mutatie Chief.
Een postdoc in ons lab zal zich bij mij voegen om de procedure te demonstreren. Nucleër eerst de ogen van een verdoofde muis en breng de ogen over in geoxygeneerde hepen gebufferde ringer-oplossing. Om de hoornhuid te verwijderen, houd het oog vast bij de limbus met pincetten en snijd vervolgens een cirkelvormige baan langs de ora serrata.
Trek de lens er met pincetten uit voor bolusinjecties en elektrofysiologische opnames. Gebruik pincetten met een gemengde rand om zoveel mogelijk glasvocht te verwijderen. Stabiliseer nu de oogcup door de sclera stevig vast te houden met pincetten.
Plaats een tweede set pincetten tussen de retina en de oogcup. Beweeg de pincetten langzaam rond de omtrek. Snijd de oogzenuw tussen de retina en de oogcup en verwijder de oogcup met schaar.
Maak insnijdingen vanaf de retinale periferie tot aan de oogzenuw. Of, om de hele retina te gebruiken, maak insnijdingen vanaf de periferie tot halverwege de oogzenuw om de houder te verkorten. Verwijder het overtollige gedeelte met een draaibank.
Polijst vervolgens de ruwe oppervlakken met fijn schuurpapier. Verwijder de voetjes onder de ring. Snijd de smalle punt van een plastic pipette af.
Breng vervolgens het weefsel over met wat oplossing naar de membraan. Verwijder geleidelijk de oplossing terwijl je de retina uitspreidt en het weefsel ontvouwt. Bevestig nu de retina aan de membraan met de ganglioncellen naar boven.
Snijd de houdertip van een een milliliter spuit af en plaats deze direct onder het weefsel. Trek de zuiger terug tot een volume van ongeveer 0,3 milliliter om het weefsel fysiek binnenin de membraan te plaatsen. Trek enkele borosilicaat capillaire pipetten met een weerstand van ongeveer een mega.
Breek vervolgens voorzichtig de punt van elke patch pipet. Voeg vervolgens 0,3 microliter is selectin stamoplossing toe aan 10 microliter van de hepen gebufferde ringer-oplossing. Plaats nu de membraan in de opnamekamer geperfundeerd met warme geoxygeneerde hepen gebufferde ringer-oplossing.
Positioneer de pipet met kleurstof tegen de binnenste begrenzingsmembraan met behulp van een microm manipulator. Breng de pipet verder om de binnenste begrenzingsmembraan te doorboren. Injecteer vervolgens de kleurstofoplossing in de enkele of meerdere gerichte locaties.
Laat nu 10 minuten verstrijken zodat het weefsel kan herstellen van de injectie terwijl je het bekijkt onder epifluorescentie-verlichting. Indien gewenst, breng de inzet over naar een glasbodem kweekschaal en plaats deze met de retina naar beneden. Voeg een druppel heepoplossing toe om het specimen vochtig te houden.
Plaats ook drie plekken vacuümvet rond de omtrek van de plastic ring om de inzet stevig aan de kweekschaal te bevestigen. Breng de schaal over naar het microscoopplatform na fixatie, dompel de membraan onder in de sucrosegradiëntoplossingen. Verwijder de membraan uit de plastic inzetring.
Verwijder zoveel mogelijk oplossing met Kim-doekjes en plaats het op param met de retina naar boven. Breng de paraform over met het weefsel naar de cryostatkamer en voeg een druppel OCT-medium toe. Gebruik het snelvriesapparaat om het bevriezen te versnellen.
Los het bevroren monster los en draai het om. Snijd nu het overtollige bevroren OCT af. Laat ongeveer twee millimeter rond het monster op drie zijden en millimeters van de zijkant, die aan de houder zal worden bevestigd.
Bedek de blootgestelde retinale zijde met een druppel OCT en laat het gehechte gebied vrij. Bevriez de membraan met het retinale weefsel. Plaats een druppel OCT op een koude houderring.
Plaats het bevroren monster onmiddellijk in de druppel. Snijd 10 tot 20 micron secties bij minuus 19 graden Celsius en plaats ze op warme polylysine kleefschuiven. Plaats de schuieven met de gehechte secties op een 41 graden Celsius verwarmingsplatform gedurende twee tot drie minuten in het donker.
Bewaar vervolgens de monsters bij minuus 20 graden Celsius. Dit experiment illustreert een snelle en eenvoudige karakterisering van retinale vaatwand als een uitgebreid netwerk van bloedvaten dat zich over meerdere retinale lagen uitstrekt. Door een boluslading van iso selectin te combineren met sulfa rumine onderdompeling labelen, kan levend weefsel bijna onmiddellijk in de retina worden gevisualiseerd en gescand, bloedvaten kunnen worden gelabeld van de oppervlakkige tot de diepe laag.
In tegenstelling tot relatief goed diffundeerbaar, permeëert SRH is selectin niet goed door de binnenste begrenzingsmembraan. Er zijn verschillende voordelen van fixatie met carbimide boven conventionele fixatie met para formaldehyde bij het labelen van synaptische eiwitten, bijvoorbeeld, na een korte periode van fixatie met carbimide immunofluorescentiekleuring voor de synaptische marker. PSD 95 in de IPL had een heldere gepuncteerde verschijning consistent met het on
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor de structurele beoordeling van wholemount-retina-preparaten met gebruik van retinaal weefsel van muizen. Het bevat gedetailleerde instructies voor de dissectie, het mounten en de kleuringsprocessen om de weefselintegriteit te behouden voor het beelden van synaptische eiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Immunohistochemie
- Retinale biologie
Achtergrond
- De structurele integriteit van neuraal weefsel is cruciaal voor nauwkeurige beeldvorming.
- Bestaande methoden kunnen de weefselkwaliteit tijdens dissectie in gevaar brengen.
- Fluorescente markers verbeteren de visualisatie van cellulaire componenten.
- Een vergelijking van fixatiemethoden is essentieel voor optimale resultaten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor de preparatie van retinaal weefsel.
- Om de effectiviteit van verschillende fixatiemethoden te beoordelen.
- Om imagingtechnieken voor synaptische eiwitten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Nucleatie van het oog en verwijdering van het hoornvlies.
- Scheiding van de retina van de sclera en het platmaken van het weefsel.
- Bevestiging van de retina aan een membraan via vacuümtransfer.
- Kleuring en beeldvorming van synaptische eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol behoudt de integriteit van het weefsel effectief.
- Fluorescente markers zorgen voor een superieure visualisatie.
- Vergelijking van fixatiemethoden levert belangrijke inzichten op.
- Deze techniek is toepasbaar op live-tissue imaging.
Conclusies
- De beschreven methode verbetert de structurele beoordeling van retineweefsel.
- Het biedt een betrouwbaar substraat voor de beeldvorming van synaptische eiwitten.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere neurale weefsels.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol richt zich op een kritieke uitdaging bij de ontdekking van geneesmiddelen voor neurowetenschappen: het behouden van de structurele integriteit van fragiel neuraal weefsel tijdens immunohistochemische verwerking. Door een betrouwbare visualisatie van synaptische eiwitten en vasculaire netwerken in retinaal wholemounts mogelijk te maken, ondersteunt het de validatie van targets en mechanistische risicovermindering in modellen voor neurodegeneratieve ziekten. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische assays door weefselvervormingsartefacten te minimaliseren die de readouts van target-engagement zouden kunnen beïnvloeden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de lokalisatie van synaptische eiwitten en de architectuur van de retinale vasculatuur in ziektemodellen.
- Operationele waarde: Biedt een gestabiliseerd platform voor consistente antilichaamkleuring en toediening van fluorescente markers.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste uitlezingen van synaptische marker-puncta en vasculaire netwerken.
- Operationele waarde: Compatibel met multi-well plate-formaten voor gestandaardiseerde workflows voor immunostaining en imaging.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de continuïteit van live-tissue imaging naar analyse van gefixeerd weefsel voor studies naar target engagement en pathway-modulatie.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit in histologische preparaten, waardoor de reproduceerbaarheid bij preklinische beoordelingen van effectiviteit en veiligheid wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypothesen in neuraal weefsel tot de preklinische validatie van modulator-effecten op de synaptische integriteit en vasculaire functie.
- Discovery Biology: Faciliteert mechanistische risicoreductie door duidelijke visualisatie van de distributie van synaptische eiwitten en de integriteit van de neurovasculaire eenheid mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve immunofluorescentie-outputs die geschikt zijn voor high-content analyse van de effecten van verbindingen op de retinale structuur.
- Analytics: Genereert puncta-dichtheid en metrieken voor het vasculaire netwerk die een vergelijkende analyse tussen experimentele condities ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Maakt het mogelijk om retinale synaptische en vasculaire biomarkers af te stemmen op preklinische ziekteprogressie en behandelrespons.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor weefselstabilisatie dat toepasbaar is op meerdere neurale weefseltypen en kleuringsprotocollen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-validatie door ondubbelzinnige synaptische en vasculaire visualisatie in fragiel neuraal weefsel.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van assays en verlaagt de faalpercentages bij immunohistochemische verwerking van delicate preparaten.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door het aantal fout-negatieven als gevolg van weefselschade tijdens de preparatie te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van neuroprotectieve verbindingen mogelijk op basis van betrouwbare structurele en functionele read-outs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgische dissectie en technieken voor weefselbehandeling.
- Is afhankelijk van de toegang tot ring-ondersteunde gehydrofiliseerde PTFE-membranen en een zuigtransferapparaat.
- Vereist standaardisatie van fixatie-, kleurings- en beeldvormingsprotocollen tussen onderzoeksteams.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan variërende weefseldikte en fragiliteit in verschillende neurale modellen.
- Praktische beperkingen omvatten de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur om het ondersteunende membraansysteem voor te bereiden en te onderhouden.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
2:50
Mounting onto Hydrophilized PTFE Membrane Insert
3:43
Bolus Injection of Isolectin Alexa 488
5:05
Vertical Sectioning of Membrane-mounted Tissue
6:45
Results: Hydrophilized PTFE Membrane for Wholemount Retina
1:38
Dissection of Wholemount Retina
8:04
Conclusion
