Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Het algemene doel van deze procedure is om levensvatbare cardiomyocyten te isoleren uit zieke humane ventriculaire monsters en hun functionele veranderingen te karakteriseren. Dit wordt bereikt door eerst snel verse ventriculaire monsters te verzamelen en te snijden in ijskoude cardioplegische oplossing om overmatige weefseldegradatie en celbeschadiging te voorkomen. De tweede stap is om een stapsgewijze spijsvertering van de myocardiumklonters uit te voeren met behulp van een op maat gemaakt spijsverteringsapparaat en enzymatische oplossingen.

In zes cycli wordt de celbevattende buffer in een buis verzameld bij elke cyclus en verdund met een celbeschermende oplossing. De laatste stap is om de cellen in de zes buizen op te schorsen in een lagere volume standaard fysiologische oplossing met normale calciumconcentraties om de functionele karakterisering uit te voeren. Uiteindelijk wordt patch clamp-opname van actiepotentialen en gelijktijdige beoordeling van intercellulair calcium met behulp van fluorescerende kleurstoffen gebruikt om de veranderingen van actie, potentiaalduur en intracellulair calciumcyclus in cardiomyocyten van patiënten met hypertrofische cardiomyopathie te tonen.

Het belangrijkste voordeel van DYS unique over een 16-methode, zoals de standaard chunk dejection-methode, is dat we in associatie met enzymoplossing een op maat gemaakt spijsverteringsapparaat gebruiken, dat dankzij zijn siliconen schrapers een gezamenlijke de-associatie van variabelecyten mogelijk maakt. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de cardiologie te beantwoorden, zoals hoe de bekende moleculaire en structurele remodellering geassocieerd met hartziekten zich weerspiegelt in de verandering van enkele cardiomyocyten die door onze methode kunnen worden geanalyseerd en door specifieke geneesmiddelen kunnen worden gericht. Dus de implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapie van genetische hartziekten zoals hypertrofische cardiomyopathie.

In feite kan deze methode worden gebruikt om nieuwe neuropathische benaderingen te testen op ventriculaire cardiomyocyten van patiënten met hypertrofische of ischemische hartziekten die een hartoperatie hebben ondergaan. We hadden eerst het idee voor deze methode bij het vergelijken van de analogie tussen humane arteriemonsters en ventriculaire biopsiën verkregen tijdens hartchirurgie. Begin deze procedure door 40 milliliter cardioplegische oplossing in een 50 milliliterbuis te gieten en bewaar het in ijs voor monsterstransport van de operatiekamer naar het celisolatielab snel het monster overbrengen naar het laboratoriumgebied en begin met monstersverwerking binnen 10 minuten na monstersverwijdering.

Verzamel vervolgens onmiddellijk na de excisie het collectieve ventriculaire myocardiummonster uit de operatiekamer. Was het met ijskoude CP-oplossing en bewaar het in de buis terwijl het monster in ijskoud CP-buffer wordt bewaard. Verwijder daarna voorzichtig de endocardiale fibrotische laag met behulp van fijne schaar.

Snijd het myocardweefsel in twee tot drie millimeter lange stukjes met een totaal gewicht van ventriculaire myocardium tussen 100 milligram en één gram voor elke isolatie. Nadat de klonters in de schrapende kamer van het spijsverteringsapparaat zijn overgebracht, verandert u de CP-buffer in de kamer met koud calciumvrij dissociatiebuffer. Plaats vervolgens het spijsverteringsapparaat in een thermostatisch bad.

Stel het bad in op 37,5 graden Celsius en zet het aan. Zet vervolgens de motor van het spijsverteringsapparaat aan en stel de rotatiesnelheid in op één omwenteling per seconde. Voer drie wascycli uit met DB en verander de oplossing in de kamer elke acht minuten met 37 graden Celsius zuurstofverzadigde schone DB.

Bereid vervolgens enzymbuffer een voor door 250 eenheden per milliliter collagenase type vijf en vier eenheden per milliliter protease toe aan de DB-oplossing. Typ 24 naar de DB-oplossing. Bereid vervolgens enzymbuffer twee voor door 250 eenheden per milliliter collagenase toe aan de DB-oplossing. Typ vijf naar de DB-oplossing. Oxygoneer EB een en warm het op tot 37 graden Celsius. Voer vervolgens twee 12-minutencycli uit voor spijsvertering in het roterende spijsverteringsapparaat met drie milliliter 100% zuurstofverzadigde EB een bij 37 graden Celsius. Verwijder de oplossing door pipettering en gooi deze na elke cyclus weg.

Bereid vervolgens zes 15 milliliterbuizen voor celcollectie en 80 milliliter vier graden Celsius craft brew-oplossing voor het uitsluiten van de buffers. Oxygoneer EB twee en verwarm het op tot 37 graden Celsius. Voer vervolgens een eerste 15 minuten spijsverteringscyclus uit met drie milliliter 100% zuurstofverzadigde EB twee bij 37 graden Celsius. Na de spijsverteringscyclus verzamelt u de oplossing die de eerste geassocieerde myocyten bevat in een 15 milliliterbuis en verdunt u de celsuspensie met 12 milliliter koude KB-oplossing.

Bewaar de buis plat op kamertemperatuur, voer vijf andere 12-minuten spijsverteringscycli uit met drie milliliter EB twee bij 37 graden Celsius en verzamel het myocytenbevattende buffer bij elke cyclus in een 15 milliliter conische buis. Vergeet niet om de verzamelde drie milliliter buffer bij elke cyclus met 12 milliliter KB-oplossing te verdunnen. Sla ten slotte de zes celbevattende buizen op bij kamertemperatuur op.

Voeg in deze stap één milligram per milliliter bovien serumalbumine toe aan 20 milliliter calciumvrije tyrbuffer. Filter vervolgens de oplossing en centrifugeer de zes myocytenbevattende conische buizen gedurende vijf minuten bij 100 kaas. Om de myocyten te dwingen zich te settelen, verwijdert u de supernatant en suspendeert u de cellen in elke buis met een variabele hoeveelheid BSA-bevattende TB bij kamertemperatuur opnieuw.

Verhoog geleidelijk de calciumconcentratie in de celbevattende buffer door kleine OTT's van 100 millimol per liter calciumchloride-oplossing toe te voegen in de eerste en tweede stappen. De calciumconcentratie wordt verhoogd tot respectievelijk 50 micromol per liter en 100 micromol per liter. De volgende calciumtoevoegstappen worden om de vijf minuten uitgevoerd en de concentratie wordt verhoogd met 100 micromol per liter bij elke stap tot een eindconcentratie van 0,9 millimol per liter.