Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen
29 januari 2014
Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de activering van complement door antilichamen tegen rode bloedcellen of RBC's in patiëntenserum te beoordelen. Dit wordt bereikt door rode bloedcellen te incuberen met patiëntenserum in aanwezigheid van blokkerend anti C vijf-antilichaam om C vier en C3-afzetting op het oppervlak van de RBC's te induceren. Vervolgens worden de RBC's gekleurd met fluorescentie gelabelde anti C vier en anti C3-antilichamen, en de hoeveelheid complementafzetting op de RBC's kan vervolgens worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie in een alternatieve methode.
De RBC's worden geïncubeerd met patiëntenserum in afwezigheid van anti C vijf om complement-gemedieerde lysis te induceren. Het percentage gelyseerd RBC's kan vervolgens worden bepaald door de hoeveelheid hemoglobine die door de cellen wordt vrijgegeven te meten door spectrometrie. Het belangrijkste voordeel van deze nieuwe techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de hemolyse of de antiglobulinetest die in routinediagnostiek wordt gebruikt, is dat deze kwalitatief van aard is en we kunnen suboptimale verschillen in complementactivering detecteren.
Elizabeth Brook postdoc in ons lab zal procedures demonstreren. Begin met het wassen van nul getypte rode bloedcellen drie keer met PBS, incubeer vervolgens de pellet in 0,5% Roma lane-oplossing met een verhouding van een tot twee gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Na het wassen van de cellen nog drie keer, bewaar ze als een 3% oplossing in vers PBS bij vier graden Celsius om complementafzetting op de RBC's te analyseren door middel van flowcytometrie. Verwarm eerst de gewenste hoeveelheid patiëntenserum gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius terwijl het serum wordt verwarmd. Was de brola-behandelde rode bloedcellen drie keer in Roal-buffer na de laatste wasbeurt.
Suspendeer het pellet in vbg plus plus met een 0,5% verdunning. Voeg vervolgens op een glazen parel 25 microliters van 0,5% RBC's toe, 37,5 microliters vers AB-serum en 37,5 microliters van 200 microgram per milliliter, anti C vijf toe aan elk putje van een 96-wells ronde bodemplaat. Voeg vervolgens het verwarmd ingeactiveerde patiëntenserum toe aan elk putje bij de juiste concentratie, aangevuld met verwarmd ingeactiveerd AB-serum indien nodig en inclusief een negatieve controle.
Gebruik VBG plus plus om elk putje tot een eindvolume van 150 microliters te brengen en incubeer vervolgens de plaat bedekt met E IA-folie gedurende anderhalf tot twee uur bij 37 graden Celsius met schudden na de incubatie. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 0,5% BSA en label vervolgens de cellen met één microgram per milliliter. Een fluorescentie gelabelde anti C3 en anti C vier monoklonale antilichamen incuberen de cellen gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden, en na het wassen van de plaat drie keer, resuspendeer de RBC's in 150 microliters PBS plus 0,5% BSA per.
Breng de celsuspensies over naar een nieuwe 96-wells ronde bodemplaat en laad vervolgens de plaat in de flowcytometer, scheid de enkele cellen van de dubbels met behulp van een voorwaartse scatterplot. Stel de poort in op de enkele RBC's en selecteer vervolgens het juiste detectiekanaal voor de fluorescente signalen. Kwantificeer de resultaten met behulp van de mediaan van de fluorescentie-intensiteit voor kwantitatieve hemolytische analyse, verwarm en activeer het patiëntenserum en was de romaine-behandelde RBC's zoals net gedemonstreerd.
Vervolgens, na het incuberen van de RBC's met complement en patiëntenserum zoals net gedemonstreerd, maar zonder de anti C vijf, centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 664 GS met verminderde deceleratie. Breng vervolgens voorzichtig 90 microliters supernatant over naar een nieuwe microtiterplaat, zorg ervoor dat u de intacte cellen niet overbrengt en vermijd het creëren van luchtbellen, en meet vervolgens de absorptie bij een 4 14 tot zes 90 in een spectrofotometer express. De hemolyse als percentage van de lysis van een monster van RBC's geïncubeerd in zuiver water.
In deze eerste figuur worden representatieve scatterplots voor brola-behandelde RBC's getoond, geschikte gating voor enkele RBC's kan hier worden gezien. Typisch valt ongeveer 95% van de RBC's binnen deze enkele cel-gating. In deze histogrammen zijn representatieve resultaten voor het effect van auto-immuun hemolytische anemie of aha.
Patiëntenserum op C vier en C3-afzetting wordt getoond zoals verwacht, meer patiëntenserum leidt tot meer complementafzetting. Opmerkelijk is dat de complementafzetting plaatsvindt in twee verschillende positieve pieken. Dit wordt waarschijnlijk niet veroorzaakt door heterogeniteit in de RBC-populatie, aangezien de RBC's van één donor zijn afkomstig, hoewel de oorzaak van dit fenomeen nog wordt onderzocht, de mediaan van de fluorescentie-intensiteiten van de monsters worden weergegeven in deze lijngrafieken om de reproduceerbaarheid van de C vier en C3-afzettingsassays te tonen.
Let op de grote variatie in de afzetting van de verschillende AH H patiëntmonsters. Ten slotte kunnen gegevens van een hemolytische test van een ahha-patiëntserumpatroon dat auto-antilichamen tegen RBC's bevat, worden waargenomen in deze grafieken. Titratie met het serummonster levert een duidelijke reproduceerbare curve op met een geschikt complementremmer zoals anti C vijf.
Het hemolytische signaal kan worden getitreerd zoals gedemonstreerd in deze grafiek. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe complementactivering door rode bloedcelspecifieke antilichamen kan worden gemeten, hetzij door middel van flowcytometrische analyse van C3 of C vier-afzetting of door kwantitatieve hemolytische test.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft twee assays voor het meten van complementactivatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's). De assays zijn kwantitatief en eenvoudig te interpreteren, wat voordelen biedt ten opzichte van bestaande methoden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Hematologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Complementactivatie is cruciaal in immuunresponsen.
- Antilichamen tegen RBC's kunnen leiden tot diverse klinische aandoeningen.
- Huidige assays kunnen tekortschieten in kwantitatieve precisie.
- Nieuwe methoden zijn erop gericht de detectie van complementactivatie te verbeteren.
Doel van de studie
- Om complementactivatie door antilichamen tegen RBC's te beoordelen.
- Om een kwantitatieve assay te ontwikkelen voor een betere interpretatie van de resultaten.
- Om nieuwe technieken te vergelijken met bestaande diagnostische methoden.
Gebruikte methoden
- Incubatie van RBC's met patiëntenserum en blokkerende antilichamen.
- Kleuring van RBC's met fluorescentie-gelabelde antilichamen.
- Analyse van complementdepositie via flowcytometrie.
- Meting van hemoglobinevrijgave om RBC-lyse te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe assays leveren kwantitatieve gegevens over complementactivatie.
- Suboptimale verschillen in activatie kunnen worden gedetecteerd.
- De resultaten tonen een verbeterde gevoeligheid in vergelijking met traditionele methoden.
- Flowcytometrie-analyse maakt een gedetailleerde interpretatie mogelijk.
Conclusies
- De nieuwe assays verbeteren het begrip van complementactivatie.
- Ze bieden een betrouwbaar alternatief voor bestaande diagnostische tests.
- Toekomstige toepassingen kunnen de diagnose en behandeling van patiënten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De kwantitatieve beoordeling van antilichaam-geïnduceerde complementactivatie op rode bloedcellen is essentieel voor het evalueren van de effectiviteit van complementremmers en het begrijpen van hemolytische mechanismen bij auto-immuun- en allo-immuunziekten. De beschreven flowcytometrie- en spectrofotometrische assays bieden reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die de detectie van suboptimale verschillen in complementactivatie mogelijk maken, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie bij de therapeutische ontwikkeling. Deze methoden verhogen het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie door kwalitatieve waarnemingen te vertalen naar meetbare, translateerbare biomarkers voor preklinische en klinische besluitvorming.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de complementdepositie (C3/C4) op RBC's te kwantificeren die wordt geïnduceerd door autoantilichamen of alloantilichamen.
- Operationele waarde: Biedt functionele targetvalidatie via directe meting van antilichaam-gemedieerde effectoractiviteit, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door kwantitatieve gegevens te genereren over de potentie van complementactivatie, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen voor complement-modulerende therapieën.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve outputs (mediaan fluorescentie-intensiteit, hemoglobinevrijgave) die geschikt zijn voor high-throughput screening van complementremmers of therapeutische antilichamen.
- Reproduceerbaarheid: Toont een lage variabiliteit tussen serummonsters van patiënten, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen en standaardisatie tussen laboratoria mogelijk maakt.
- Nut van het platform: Maakt gebruik van toegankelijke instrumentatie (flowcytometer, spectrophotometer) om herbruikbare assays te creëren voor het meten van complement-afhankelijke bioactiviteit in discovery-pipelines.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert pathofysiologische mechanismen bij auto-immuun hemolytische anemie (AIHA) en allo-immuun hemolyse, waarbij doelwitinteractie wordt gekoppeld aan functionele complementactivatie.
- Translationele continuïteit: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie door kwantitatieve biomarkers te leveren (C3/C4-depositie, hemolyse) die correleren met het klinische hemolytische potentieel.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt mechanische risicoreductie mogelijk door complement-gemedieerde lysis te kwantificeren, wat bijdraagt aan veiligheidsbeoordelingen en dosis-responismodellering in preklinische studies.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De assays zijn geïntegreerd in het continuüm van ontdekking, van doelwitvalidatie via lead-identificatie tot preklinische veiligheidsbeoordeling, en bieden kwantitatieve read-outs van complementactivatie die bijdragen aan biologische risicoreductie en de evaluatie van de therapeutische index.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door antilichaam-geïnduceerde complementactivatiepaden te kwantificeren, waardoor het werkingsmechanisme voor immunomodulerende kandidaten wordt verduidelijkt.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten (fluorescentie-intensiteit, spectrophotometrische hemolyse) die een betrouwbare vergelijking van testverbindingen of serummonsters mogelijk maken.
- Analytica: Genereert meetbare read-outs (mediane fluorescentie-intensiteit, hemoglobinevrijgave) die statistische analyse en vergelijking tussen condities in dosis-responsstudies faciliteren.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via ziekterelateerde resultaten die de complementactivatie weerspiegelen die wordt gezien bij AIHA en in transfusiesituaties.
- Enterprise-hergebruik: Creëert een schaalbaar, gestandaardiseerd platform voor het beoordelen van complement-afhankelijke activiteit voor antilichaamtherapeutica, biosimilars en complementremmers.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door kwalitatieve complementassays om te zetten in kwantitatieve, vertaalbare metingen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gedefinieerde protocollen voor de preparatie van RBC's, serumincubatie en detectie via flowcytometrie of spectrometrie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van complement-activerende risico's mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium bij immunomodulerende programma's wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering door het complementactiveringspotentieel te kwantificeren, wat objectieve beslissingen over verdere ontwikkeling in therapeutische trajecten ondersteunt.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immunologie, flowcytometrie en de uitvoering van spectrophotometrische assays voor nauwkeurige metingen van complementdepositie en hemolyse.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers met geschikte fluorescentiekanalen en spectrophotometers voor hemoglobinekwantificering bij 414/690 nm.
- Maakt standaardisatie van de RBC-preparatie (bijv. nul-type, bromeline-behandeld) en hitte-inactivatie van serum noodzakelijk om consistentie van de assay tussen gebruikers en locaties te waarborgen.
- Vereist aanpassingen bij toepassing op verschillende RBC-soorten, antigeendichtheden of complementbronnen buiten menselijk AB-serum.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige overdracht van het supernatant om celoverdracht en luchtbellen te voorkomen, wat de nauwkeurigheid van de hemolysekwantificering kan beïnvloeden.
