Anti-nucleaire antilichaam screening met HEp-2 cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om een indirect immunofluorescent assay te gebruiken om te screenen op anti-nucleaire antilichamen. Dit wordt bereikt door patiëntenserum te incuberen met hep twee substraat slides. Het vrijgekomen patiëntenserum wordt afgewassen van de gebonden auto antilichamen, die vervolgens worden geïncubeerd met een specifiek fluorescerend gelabeld conjugaat, en het vrijgekomen reagens wordt afgewassen.

Wanneer bekeken onder een fluorescentiemicroscoop, zullen auto antilichaam positieve monsters een appelgroen fluorescerende glans vertonen die overeenkomt met delen van de cel of kern waar auto antilichamen zich hebben gebonden in een fluorescerend patroon dat de aanwezigheid van het antigeen aangeeft. Uiteindelijk kan de aanwezigheid van arna worden gebruikt om de diagnose van bindweefselziekten te ondersteunen. Het belangrijkste voordeel van de indirecte immunofluorescente methode ten opzichte van andere methoden zoals solid phase Eliza, is dat de Hep twee cel substraat meer dan 100 antigenen bevat die in hun natuurlijke configuratie tot expressie worden gebracht.

Dit maakt de identificatie van bijna alle klinisch relevante O antilichamen mogelijk, wat niet mogelijk is met solid face technieken omdat de indirecte immunofluorescente methode een zeer gespecialiseerde techniek is. Personen die nieuw zijn in deze methode hebben tijd en oefening nodig om vakkundig te worden in de procedure van slide verwerking. Het interpreteren van de microscoopbeelden en het leren herkennen van relevante patronen is ook een vaardigheid die tijd kost om onder de knie te krijgen.

Met de juiste reagentia en hulpmiddelen zijn de resultaten consistenter en eenvoudiger te interpreteren. Het demonstreren van de procedure zal Cassandra Bryant zijn, een technoloog van het Immunofluorescent Asay Development Laboratory. Verwijder de reagentia uit de verpakking en laat elk item op kamertemperatuur komen, bereid de reagentia voor en verdun het patiëntenserum volgens de aanwijzingen. Insert slides zijn voorzien van een barcode en kunnen gemakkelijk worden geïntegreerd in geautomatiseerde systemen.

Deze procedure illustreert handmatige slide verwerking. Hoge doorvoer laboratoria kunnen echter kiezen voor geautomatiseerde slide verwerkingsapparatuur met barcode scan mogelijkheden. Inova instrumenten zijn verbonden via een gecentraliseerd intelligent netwerk dat controle biedt over workflow resultaten en rapportage.

Voor IFA. Dit resulteert in positieve patiëntidentificatie van verwerking en elimineert transcriptie- en gerelateerde fouten. Doe een druppel positieve controle en een druppel negatieve controle op de juiste slide.

Pipet 20 tot 25 microliters verdund patiëntenserum in de resterende putjes. Verwerk één slide tegelijk. Plaats de slide in een kleding container met een vochtige papieren handdoek op de bodem, dek de container af en incubeer de slide gedurende 30 minuten.

De vochtige omstandigheden zullen voorkomen dat het substraat uitdroogt, wat zou kunnen resulteren in artefactueel kleuren. Tijdens deze incubatieperiode zullen de anti-nucleaire antilichamen in het serum van de patiënt zich binden aan antigenen van de cellen die op elk putje zijn bevestigd. Na de incubatieperiode, spoel het serum af met een zachte stroom wasbuffer om beschadiging van het substraat te voorkomen.

Kantel de slide lichtjes zodat de stroom niet direct op het substraat is gericht. Deze oriëntatie van de slides zal ook helpen om kruisbesmetting van monsters tussen de putjes te voorkomen. Tap overtollig wasbuffer af en plaats de slide in een Copeland pot met wasbuffer.

De incubatietijd voor de wasstap moet ongeveer vijf minuten zijn. Verwijder de slides uit de wasbuffer en tap zachtjes. Om het overtollige wasbuffer te verwijderen, breng één druppel fluorescent conjugaat aan op elk putje.

Voor een NA test wordt het gebruik van een IgG FC specifiek conjugaat aanbevolen. Incubeer de slides gedurende 30 minuten in de bevochtigde container en zorg ervoor dat het kleedje wordt vervangen. Het conjugaat is lichtgevoelig en het kleedje beschermt de slides tegen lichtblootstelling.

Tijdens deze incubatieperiode zal het conjugaat zich binden aan de anti-nucleaire antilichamen van de patiënt die zich hebben gebonden aan de cel antigenen. Deze binding van het conjugaat resulteert in de aanwezigheid van fluorescentie in de putjes na incubatie. Was de slide met wasbuffer.

Zoals eerder, plaats een dekglas op een papieren handdoek en breng montagemedium aan in een doorlopende lijn naar de onderkant van het dekglas. Verwijder elke slide uit de wasbuffer en tap zachtjes op de slide. Om het overtollige wasbuffer te verwijderen, raak de onderkant van de slide aan de rand van het dekglas.

Laat de slide voorzichtig op het dekglas zakken op een manier dat het montagemedium op het dekglas naar de bovenkant van de slide stroomt zonder luchtbellen te dekken. Het dekglas inschuiven, inclusief de optimale hoeveelheid montagemedium, is een techniek die oefening vergt om perfect te worden. Slides met een fluorescentiemicroscoop in een donkere ruimte, scannen van de hele put moet worden uitgevoerd met een 20 x of 25 x objectief. Om de celverdeling en uniformiteit van de fluorescentie te beoordelen, schakel over naar een 40 x objectief.

Om de uiteindelijke interpretatie over positiviteit en patroon te maken, kijk naar de positieve en negatieve controles. De negatieve controle zal mogelijk niet helemaal donker lijken, maar zal vaak een laag niveau van niet-specifieke fluorescentie vertonen. De positieve controle zal heldere appelgroene fluorescentie in de kern vertonen.

Positivitieit kan worden gegradueerd door gebruik te maken van een reactiviteitsgradatieschaal van één plus tot vier plus. Naast handmatige interpretatie kunnen slides worden geladen en gescand door de geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop. Een donkere ruimte is niet nodig.

Na het maken van een project door het selecteren van het juiste slide type, verwerft het instrument en slaat hoge resolutie digitale beelden van cellen in elke put op. Bovendien meet Nova view de fluorescentie intensiteit en categoriseert de resultaten als positief of negatief en biedt patroonherkenning voor positieve monsters. De beelden worden door de operator bekeken op een hoge resolutie computer monitor, waardoor de uiteindelijke interpretatie, revisie en bevestiging van Nova View mogelijk is.

Resultaatrapporten kunnen worden gegenereerd op bevestigde resultaten. Auto-antilichaam binding op de samenstellende eiwitstructuren binnen de kern resulteert in vijf be