Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Het algemene doel van het volgende experiment is om de transiente genexpressie van een GFP-gelabelde reporter te observeren in epidermiscellen van tabaksbladeren. Dit wordt bereikt door eerst een DNA-construct te ontwerpen dat in het chloroplast en peroxisomen zal worden geëxpresseerd. Het construct wordt vervolgens gebouwd met behulp van PCR-amplificatie en Gibson-assemblage.

Vervolgens wordt een gene gun gebruikt om het construct af te leveren aan epidermiscellen van tabaksbladeren. Uiteindelijk onthult beeldvorming van het tabaksblad door confocale microscopie GFP-expressie in het chloroplast en peroxisomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassieke klonen, is dat het geen restrictie-enzymen vereist, en dus kan elke sequentie die door PCR kan worden geamplificeerd, worden gekloneerd.

Vanwege de flexibiliteit van het genetische ontwerp, breiden de toepassingen van deze technieken zich uit naar een grotere schaal. Genetische manipulatie van landbouwgewassen Begin dit protocol door de sites binnen de plantcel te bepalen voor de uiteindelijke eiwitexpressie. Voor dit werk is het doel om de expressie te richten op het chloroplast, peroxisomen en cytosol.

Ontwerp vervolgens het expressieconstruct. Het construct moet een promotor, een detecteerbaar gen en een terminator binnen een enkel plasmide bevatten. In dit geval drijft de constitutieve promotor P end cup twee de expressie van GFP aan, gevolgd door de Nolene Synthe, terminator of nos t.

Merk op dat we in dit experiment een reeks tags, trit-tags, een, twee en drie, uitgedrukt aan het terminale einde van GFP, zullen testen voor expressie in chloroplasten en peroxisomen. De Gibson-assemblagemethode is afhankelijk van de werking van verschillende enzymen in een vooraf gemaakte mix om de uiteinden van dubbelstrengs DNA gedeeltelijk te verteren en het annelen van complementaire basenparen van aangrenzende DNA-sequenties te vergemakkelijken. Het uiteindelijke construct heeft drie delen die in vier PCR-reacties moeten worden geamplificeerd voorafgaand aan Gibson-assemblage.

De eerste en tweede reacties versterken een plasmidevector van 8.000 basenparen, PORE, die GFP NOS T en een cany-resistentiemarker bevat. De resistentiemarker is een goede plek om deze grote DNA in twee kleinere templates te verdelen die gemakkelijker door PCR kunnen worden versterkt. De derde reactie versterkt de promotor P end cup twee en de vierde reactie versterkt triag een met behulp van in silico ontwerpsoftware zoals ape design, de constructie base per base, zodat er een overlap van 50 basenparen is tussen elk stuk.

Bij het bestellen van primers voor PCR is het mogelijk om de overlap van 50 basenparen te gebruiken als de primers 25 basenparen in elke richting Na het uitvoeren van PCR om elk component te versterken, zuiveren de PCR-producten afzonderlijk en verdun ze in gedistilleerd gedeïoniseerd water. Als het PCR-sjabloon een miniprep van e coli-behandeling met restrictie-enzym DPN was, zal men het verontreinigende sjabloon-DNA verwijderen. Meet vervolgens de concentraties van elk van de DNA-stukken.

Pas de vectorconcentratie aan tot ongeveer 150 nanogram per microliter voor elk te assembleren construct, inclusief een controle, neem een 15 microliter aliquot van het Gibson Assembly-mengsel uit de vriezer en ontdooi het op ijs. Gebruik de online open source tool@gibbon. org om de volumes voor equimolare hoeveelheden van elk van de fragmenten te bepalen.

Voeg het berekende volume van elk van de fragmenten toe aan de 15 microliter Gibson-mix. Bereid ook een controle van het vector-DNA alleen voor. Het totale volume van elke reactie moet 20 microliter zijn.

Gebruik water om het volume indien nodig aan te passen. Incubeer de buisjes gedurende 30 tot 60 minuten bij 50 tot 55 graden Celsius. Na de incubatie, plaats de buisjes terug op ijs.

Haal een micro fuge-buisje met een commerciële bereiding van 200 microliters calciumchloride competente e coli uit een vriezer van min 80 graden Celsius en verwarm het iets met de hand. Voeg vervolgens alle 20 microliters van de reactie toe aan de e coli. Incubeer de culturen gedurende 30 minuten op ijs, draag ze vervolgens over naar een waterbad van 42 graden Celsius en schok ze gedurende 60 seconden met warmte.

Gebruik geen elektrocompetente cellen. De relatief hoge zoutconcentratie en lage DNA-concentratie kunnen ervoor zorgen dat de cellen na transformatie boogsgewijs worden. Breng de culturen gedurende twee minuten terug naar IJS, voeg vervolgens 750 microliters SOC- of LB-medium toe en laat ze 30 minuten bij 37 graden Celsius herstellen.

Plateer vervolgens het mengsel op LB-platen met cany of ander geschikt antibioticum, incubeer bij 37 graden Celsius overnacht en screen 10 kolonies door middel van sequencing. Merk op dat deze methode mogelijk resulteert in een hogere achtergrond en een hoger aantal niet-doelgerichte recombinatiegebeurtenissen dan traditioneel ligatie-gebaseerde klonen. De biotische transfectie van tabak met een gene gun is eerder beschreven in JoVE.

Hier worden belangrijke stappen en verschillen beoordeeld van eerdere protocollen. Na het versterken en isoleren van de constructen, bereid gene gun-kogels voor zoals beschreven in het JoVE-artikel van Woods en Zeto en laad ze in de gene gun voor transfectie van Nico Tania Benham Miana tabaksblad epidermisweefsel. Kies een groot blad dicht bij de basis van een drie tot vijf maanden oude plant.

Plaats het voorzichtig met de onderkant omhoog op natte papieren handdoeken in een 15 centimeter Petri-schaal met geschikte oog- en oorbescherming. Stel de heliumdruk voor de gene gun in op 200 tot 250 PS.I, richt de gene gun voorzichtig tussen de ribben op de onderkant van een blad, ongeveer drie tot vijf centimeter erboven. Laat de veiligheid los en lever de deeltjes af aan het blad.

Gebruik elke kogel twee keer op dezelfde locatie op het blad. Ga naar een andere locatie en herhaal het proces als het blad explodeert, gooi het weg en begin met een nieuw blad. Er is enige variatie in de taaiheid van het blad vanwege groeiomstandigheden zoals leeftijd, vocht, enzovoort.

Nadat alle schoten zijn gegeven, bedek het blad en bewa