DNBS / TNBS Colitis modellen: Inzicht geven Into Inflammatory Bowel Disease en effecten van vet in de voeding

Het algemene doel van deze procedure is om een alternatieve en goedkope methode te bieden om inflammatoire darmziekte of IBD te bestuderen met behulp van DY nitro benzeen zonisch zuur of DNBS. Dit wordt bereikt door DNBS eerst intrarectaal toe te dienen via zachte inbrenging in de anus. In de tweede stap worden weefselsecties van de dikke darm verkregen voor histologisch onderzoek en om de myeloperoxidase-activiteit van de DNBS-uitgedaagde weefsels te beoordelen, uiteindelijk kunnen de effecten van dieetoliën op gewichtsverlies en colitis worden geëvalueerd door zowel macroscopische als microscopische methoden.

Het belangrijkste voordeel van deze zaak ten opzichte van de bestaande dextron natriumsulfaatmethode is dat de DNBS-methode eenvoudig uit te voeren is, goedkoper en zeer reproduceerbaar. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het IBD-onderzoeksveld, zoals wat zijn de rollen van stress en depressie bij het terugkeren van IBD, of wat zijn de onderliggende mechanismen bij darmletsel en reparatie Voor rectale installatie van DNBS in muizen begint met het bevestigen van een enkele milliliter spuit op een 19 gauge naald. Uitgerust met een polyethyleen 50 katheter, zuigt dan vers bereid DNBS in de katheter.

Breng vervolgens traanvochtgel aan op een verdoofde muis en oefen lichte druk uit met de vingertoppen op het achterste uiteinde van het dier om eventueel aanwezig ontlasting in de distale colon te verwijderen. Injecteer nu een kleine hoeveelheid van de DNBS-oplossing om de colon te smeren voor gemakkelijkere inbrenging terwijl u de katheter voorzichtig intrarectaal ongeveer drie tot vier centimeter inbrengt. Zodra de katheter op zijn plaats is, injecteert u 100 microliters DNBS of een gelijk volume van 50%ethanol voor de controledieren.

Plaats het dier vervolgens 90 seconden met de kop naar beneden om verlies van de reagentia te voorkomen. Na toediening van DNBS, voer de dieren 8%sacharose water in 0,2%zoutoplossing om uitdroging gedurende de eerste week te voorkomen. Volg zorgvuldig het dagelijks gewichtsverlies, uitdroging of nood van het dier gedurende de duur van het experiment op het gewenste tijdstip.

Na DNBS-uitdaging, open de buikholte van het geëuthaniseerde dier en verwijder de gehele dikke darm. Open vervolgens de darm longitudinaal. Macroscopische mucosale ulcera moeten worden waargenomen ongeveer twee tot drie centimeter proximaal vanaf het distale uiteinde van de colon.

Verzamel 0,5 centimetersecties proximaal van de plaats van maximale macroscopische schade in de experimentele dieren en segmenten van de colon van de overeenkomstige anatomische locaties van de controledieren. Bevriest vervolgens snel 0,5 centimeter van een controle en 1D NBS-behandelde sectie in vloeibare stikstof voor beoordeling van myelo peroxidase-activiteit en fixeert de andere secties in 10% neutraal gebufferde formin overnacht of histologische analyse. De volgende ochtend, was de formaline gefixeerde weefsels met 70%ethanol en plaats ze in een cassette om naar een histologiefaciliteit te sturen om in paraffine te worden ingebed en gekleurd met hematine en eoine voor histologische scoring.

Score vervolgens ten minste drie weefselsecties van elk dier onder een lichtmicroscoop om de histologische schadescores voor elke groep te bepalen Om de myelo peroxidase-activiteit van de DNBS-uitgedaagde weefsels te meten. Homogeniseer eerst het snel bevroren controle- en experimentele weefsel in myelo peroxidase homogenisatiebuffer tot een 50 milligram colon segment per milliliter van homogenisatiebuffer suspensie. Verdeel vervolgens de gehomogeniseerde oplossing in porties van één milliliter en centrifugeer ze gedurende twee minuten bij 10.000 keer g en vier graden Celsius.

Breng vervolgens 100 microliters van elke aliquot over in individuele cuvettes en voeg 2,9 milliliter PBS toe dat is aangevuld met IDE, dihydrochloride en waterstofperoxide met krachtig mengen. Ten slotte meet u de absorptiesnelheid met behulp van een spectrofotometer bij 460 nanometer. Volgend intrarectale uitdaging met DNBS zoals zojuist aangetoond.

Aanzienlijk gewichtsverlies wordt waargenomen na 48 uur bij ratten die zijn aangevuld met vis of canola olie, en na 72 uur bij ratten die zijn aangevuld met saffloerolie. Het maximale gewichtsverlies dat wordt waargenomen, komt voor na 48 uur bij visolie, aangevulde ratten, en na 72 uur bij ratten. Aangevuld met canola- of saffloerolie.

Gewichtstoename hervatte na 72 uur en vijf dagen na DNBS-toediening vertoonden visolie en saffloerolie behandelde groepen lichaamsgewichten vergelijkbaar met hun basislijnwaarden. Controleratten die zijn aangevuld met de voedingsolie en uitgedaagd met intrarectaal ethanol, namen gedurende de gehele vijfdaagse studieperiode constant aan gewicht toe. De darmschade veroorzaakt door DNBS kan wijdverspreid zijn.

Echter, het gebied van maximale schade is over het algemeen gelokaliseerd in de distale zes centimeter van de colon bij ratten en de distale drie centimeter bij muizen. Bij nadere histologische beoordeling worden uitgebreide epitheliale verwondingen waargenomen, inclusief de vorming van ulcera, neutrofielen en lymfocyten infiltratie, mucus depletie en oedeem. Hoewel deze histologische tekenen van ontsteking en weefselschade duidelijk zijn in alle drie de groepen die zijn aangevuld met dieetoliën bij uitdaging met DNBS, wordt de ernstigste schade gezien in de saffloerolie groep, gevolgd door de canola olie groep.

Terwijl ratten in de visolie groep minimale epitheliale verwondingen en een beperkte infiltratie van ontstekingscellen in het mucosacosa vertonen. Verschillen in histologische schade tussen de monsters kunnen worden gekwantificeerd om een betere vergelijking tussen de groepen mogelijk te maken. De grafiek illustreert de histologische schadescores voor de drie dieet olie groepen tijdens DNBS colitis.

Zoals waargenomen in de h en e gekleurde secties, vertoont de saffloerolie aangevulde groep de grootste omvang van schade gevolgd door de canola olie groep. Terwijl de visolie groep de minste hoeveelheid schade vertoont, kan de omvang van ontstekingscelinfiltraat, met name van neutrofielen, verde