Een protocol voor het analyseren van hepatitis C virus replicatie

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van verschillende fasen van de replicatiecyclus van het hepatitis C-virus. Dit wordt bereikt door eerst HCV-genomische RNA-transcripten te genereren uit gelineariseerde HCV-plasmideconstructen. De tweede stap is het transfecteren van de cellen met H-C-V-R-N-A. Vervolgens worden de cellen uitgeplaat voor verschillende tijdspunten en assays. De laatste stap is het verzamelen van het supernatant van de celkweek voor het meten van de virale titer en het oogsten van de getransfecteerde cellen voor eiwit- en RNA-analyse. Ten slotte worden reverse transcription-PCR, Western blotting, een immunofluorescentie-assay en de HCV-titer bepaald, wat aantoont dat er sprake is van een robuust infectieus HCV-celkweeksysteem.

Het belangrijkste voordeel van dit celcultuursysteem voor het infectieuze hepatitis C-virus ten opzichte van het HCV-repliconsysteem is dat de stappen van virale entry, virionassemblage en egress kunnen worden onderzocht. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de hepatitis C-virologie, zoals virionmorfogenese en de interactie tussen gastheer en pathogeen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de ontwikkeling van vaccins, omdat het de karakterisering mogelijk maakt van geattenueerde virale stammen die kunnen worden geëvalueerd als potentiële vaccinkandidaten.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het hepatitis C-virus, kan deze ook worden toegepast op andere RNA-virussen uit de familie van de Flaviviridae. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode voor de uitdaging staan om genomisch HCV-RNA van hoge kwaliteit te genereren. Het bestuderen van de volledige replicatiecyclus van HCV werd haalbaar in celcultuur na de ontdekking van een genotype-2A HCV Japans fulminant Hepatitis one isolaat. Visuele demonstratie van de virologische assay is essentieel, omdat de assay expertise vereist in zowel moleculaire als cellulaire technieken.

Gebruik een intra-genotype 2A chimeer virus, F-N-X-H-C-V en een F-N-X-H-C-V pol-null HCV voor de evaluatie van virale replicatie; lineariseer hiervoor eerder gegenereerde virale plasmiden door digestie met het restrictie-enzym XBA-one in een buisje van twee milliliter. Behandel de plasmiden vervolgens met mungboon-nuclease om blunt ends te genereren.

Zuiver de gedigesteerde plasmiden middels anionenuitwisselingschromatografie. Verifieer de integriteit van het gelineariseerde plasmide door het DNA te onderwerpen aan agarosegelelektroforese. Voeg vervolgens het gelineariseerde plasmide-DNA-template toe aan een buisje van 0,2 milliliter met reactiecomponenten voor T-seven RNA-polymerase om HCV genomische RNA-transcripten te synthetiseren.

Zuiver het nieuw gesynthetiseerde, met DNase behandelde RNA met behulp van een RNA-zuiveringskit. Verifieer vervolgens de RNA-productie via agarosegelelektroforese. Kwantificeer daarna het RNA door middel van spectrofotometrie.

Los Huh-7 adherente cellen los met een trypsinebehandeling en verzamel de cellen in een conische buis van 50 milliliter. Resuspendeer na twee opeenvolgende centrifugaties de celpellet in koud medium met een laag serumgehalte. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de cellen vervolgens in medium met een laag serumgehalte op een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per milliliter.

Meng vervolgens in totaal 10 µg getranscribeerd viraal RNA met 400 µL geresuspendeerde cellen in een vooraf gekoelde electroporatiecuvet van 0,4 cm. Breng het virale RNA de cellen in via electroporatie bij 270 V, 100 Ω en 950 µF. Resuspendeer de geëlectroporeerde cellen na afloop in 10 mL compleet groeimedium met 15% FBS. Plaats de cellen op dit punt in zowel T 25-kolfjes met ongeveer 1,2 × 10⁶ cellen per kolfje als in 48-wells platen met 1 × 10⁴ cellen per well voor tijdspunten van 4, 48 en 96 uur. Vervang het medium vier tot acht uur na transfectie door vers aangevuld groeimedium met 10% FBS om dode celresten uit de gekweekte kolfjes en platen te verwijderen.

Oogst de supernatanten van de celcultuur op de tijdstippen van 48 en 96 uur met een serologische pipette in een conische buis van 15 milliliter. Verwijder vervolgens celresten uit de verzamelde monsters door centrifugatie bij 15.000 rpm gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Bewaar de celvrije supernatanten na centrifugatie bij negatief 80 graden Celsius.

Lyseer de cellen voor eiwit- en RNA-analyse via western blot en reverse transcriptase kwantitatieve PCR of RT-qPCR op de aangegeven tijdstippen. Zet één microgram totaal cellulair RNA om in cDNA met behulp van het reverse transcriptase-enzym en een specifieke primer voor de HCV-sense-streng die bindt aan de 5'-niet-vertaalde regio in een buisje van 0,2 milliliter. Zet daarnaast F-N-X-H-C-V-R-N-A van bekende genoomkopieën om in cDNA met behulp van een HCV-sense-strengprimer. Voer qPCR uit met een real-time PCR-systeem door 50 nanogram van het resulterende cDNA te gebruiken, samen met specifieke HCV-primers en een qPCR-supermix die DNA-bindende groene kleurstof bevat. Gebruik de volgende condities bij het uitvoeren van de qPCR om het H-C-V-R-N-A-kopiegetal te bepalen. Scheid na de qPCR het cellysaat van het virale RNA dat 96 uur na transfectie is getransfecteerd met behulp van SDS-PAGE. Transfer de gescheiden eiwitten in de gel vervolgens naar een polyvinylideenfluoride-membraan via de trans-blot turbo-methode. Blokkeer het membraan met een blokkeringsoplossing bestaande uit 5% magere melk en 0,2% Tween-20 in PBS en plaats dit in een container.

Incubeer het membraan met primaire muis monoklonale antilichaam NS3 in een verdunning van 1:1000 en bèta-actine in een verdunning van 1:5.000 in een koelkamer van 4 °C. Voeg na incubatie geit anti-muis immunoglobuline-G geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase toe in een verdunning van 1:5.000 en detecteer middels chemiluminescentie.

Fix op dit punt de met HCV-RNA getransfecteerde cellen met methanol gedurende 30 minuten bij -20 °C voor de immunofluorescentie-assay. Was de cellen na afloop drie keer met PBS. Gebruik na blokkeren met immunofluorescentie-assay blokkeringsbuffer het konijn polyklonaal anti-NS5A primaire antilichaam en het muis monoklonaal anti-dsRNA antilichaam J2 in een verdunning van 1:200 en incubeer dit gedurende vijf uur tot overnacht in een koelruimte van 4 °C. Was de cellen na de incubatie drie keer met PBS na het primaire antilichaam. Voeg vervolgens geit anti-konijn immunoglobuline-G 488 polyklonaal secundair antilichaam en geit anti-muis immunoglobuline 594 polyklonaal secundair antilichaam toe in een verdunning van 1:1000 en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur op een tafelrocker. Kleur na het drie keer wassen van de cellen met PBS de kernen met Hoechst-kleurstof en observeer deze met een fluorescentiemicroscoop.

Zaai vervolgens naïeve Huh7.5.1-cellen uit in een 96-wells plaat met ongeveer 3 × 10³ cellen per well. Voer de volgende dag een tienvoudige seriële verdunning uit van celvrij cultuursupernatans, geoogst van HCV-RNA-getransfecteerde cellen, met gebruik van groeimedium en inoculeer dit in triplo op de Huh7.5.1-cellen. Fixeer de cellen 72 uur na infectie gedurende 30 minuten met methanol bij -20 °C. Nadat de cellen uit de vriezer zijn gehaald, worden ze immunogekleurd voor het HCV NS5A-eiwit volgens de eerder beschreven condities. Tel met een fluorescentiemicroscoop de NS5A-positieve cel-foci in de well met de hoogste virale verdunning en bereken het gemiddelde aantal focus-forming units per milliliter.

De kwaliteit van het gelineariseerde HCV-plasmide werd beoordeeld via gelelektroforese. Het HCV-DNA werd onderworpen aan in vitro transcriptie gemedieerd door T7 RNA-polymerase, wat resulteerde in een enkel RNA-product van 9,6 kb. RT-qPCR-resultaten gaven aan dat het wildtype-virus het genoom efficiënt repliceerde. Het wildtype vertoonde een één tot drie log hogere mate van genoomreplicatie vergeleken met het pol-null-virus.

Het wildtypevirus produceerde het NS3-eiwit dat betrokken is bij de virale eiwitsplitsing en genoomreplicatie. Het wildtypevirus expressieerde ook het NS5A-eiwit, waarbij het NS5A-eiwit en dubbelstrengs RNA colokaliseerden in het cellulaire cytoplasma van wildtype-getransfecteerde cellen, wat wijst op actieve virale replicatie. Metingen van de virustiter gaven aan dat het wildtypevirus infectieus is en meer dan 10.000 foci forming units per milliliter infectieuze deeltjes produceert. Zes uur na transfectie vertoonden zowel het wildtype- als de pol-null-virussen vergelijkbare luciferase-activiteiten, wat aangeeft dat een vergelijkbaar inputniveau van getransfecteerd RNA was vertaald. Echter, 48 uur en 96 uur na transfectie vertoonde het wildtypevirus verhoogde niveaus van genoomreplicatie in vergelijking met het pol-null-virus. Het wildtypevirus produceerde tevens viraal NS3-eiwit. Het pol-null-virus vertoonde een basale luciferase-activiteit, terwijl het wildtypevirus een twee tot drie log hogere replicatiegraad had in vergelijking met het pol-null-reportervirus. Zodra men hierin vaardig is, kunnen virologische assays voor Hepatitis-C in twee weken worden voltooid, mits ze correct worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om robuuste cellen en hoogwaardige HCV-genomische RNA-transcripten te gebruiken. Na deze procedure kunnen gekarakteriseerde HCV-stammen worden getest in diermodelssystemen om de in vivo fitness en gastheer-pathogeeninteracties te onderzoeken.

De ontwikkeling van een infectieus HCV-celcultuursysteem heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om de virion-morfogenese en de stappen van virale egress in de HCV-replicatiecyclus te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van verschillende virologische assays voor het karakteriseren van diverse stadia van de replicatiecyclus van het hepatitis-C-virus. Vergeet niet dat werken met het hepatitis-C-virus extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd veiligheidsvoorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens het uitvoeren van deze procedure.