Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel
28 maart 2014
Hier laten wij het gebruik van fluorescente Alexa kleurstof gekoppeld met α-bungarotoxine aan GABAA-receptor oppervlak lokalisatie en endocytose in hippocampale neuronen meten. Door het gebruik van constructies, voorzien van een korte extracellulaire tag die bindt α-bungarotoxin, kan de analyse van plasmamembraaneiwit endocytische mensenhandel worden bereikt.
Het algemene doel van deze procedure is om de oppervlaktelokalisatie en endocytose van gabaa-receptoren in hippocampale neuronen te meten. Dit wordt bereikt door eerst hippocampale neuronen te doorsnijden met de getagde gabaa-receptorsubeenheid en de gekweekte neuronen vervolgens te laten ontwikkelen in de incubator. De tweede stap is om oppervlakte gabaa-receptoren te labelen met alpha bungalowtoine gekoppeld aan fluorescente Alexa die.
Vervolgens worden de neuronen gedurende verschillende tijdstippen geïncubeerd om gelabelde receptoren te laten endocytose. De laatste stap is om de monsters op de juiste tijdstippen te fixeren en immunokleuring uit te voeren met anti-GFP om het totale getagde receptorpool te observeren. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om veranderingen in oppervlaktelokalisatie en endocytose van de getagde gabaa-receptoren te tonen met behulp van vaste of levende beeldvormingsbenaderingen.
Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van receptorverkeer, zoals welk effect ligandbinding kan hebben op receptorendocytose en invoegsnelheden, en of verschillende liganden en modulatoren de receptorrecycling en afbraak kunnen beïnvloeden. Hoewel deze methode is gebruikt om geligeerde ionkanalen en G-proteïne-gekoppelde receptoren te bestuderen, voornamelijk in de context van het zenuwstelsel, kan deze ook worden toegepast om de dynamische lokalisatie en het verkeer van andere membraaneiwitten in celkweek en primaire cellen van verschillende weefsels te bestuderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode om twee redenen worstelen.
Eerst om functionele constructen te maken en ten tweede de oefening en ervaringen die nodig zijn om meerdere tijdstippen tegelijkertijd te verwerken. Om te beginnen, bereid vier tot vijf ronde poly de lysine gecoate glazen deksels voor binnen elke 3,5 centimeter weefselkweekschaal zoals beschreven in het tekstprotocol. Vervolgens transfecteer vers gedissocieerde neuronen op de dag van het kweken met één tot vier microgram van maxi voorbereide construct DNA-plaat.
De getransfecteerde neuronen op de poly de lycine gecoate deksels met een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 200.000 neuronen per 3,5 centimeter schaal. Vervang het medium vier tot 24 uur na bereiding van neuronale culturen. Laat vervolgens de neuronen zich ontwikkelen in de incubator tot 14 tot 17 dagen in vitro of het gewenste stadium om de endocytose-assay uit te voeren.
Stel eerst een tafelkoel-verwarmingsapparaat in op 16 graden Celsius. Koel extracellulaire hopen, gebufferd zoutoplossing of HBS tot 16 graden Celsius in een waterbad. Breng de neuronenschalen over naar de aluminium plaat op 16 graden Celsius en koel gedurende vijf minuten.
Verwijder het medium en vervang het met één milliliter van 16 graden Celsius HBS plus 150 Micromolar twee Bo Rine gedurende twee minuten. Vervolgens verwijdert u het medium naar een gelabelde afvalcontainer en vervangt u het met één milliliter van 16 graden Celsius HBS plus twee bo kerine plus alpha bungalow toxine. Alexa 5 9 4 incuberen bij 16 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Na incubatie, brengt u het medium over naar een gelabelde afvalcontainer en wast u de schalen drie keer met twee milliliter van 16 graden Celsius HBS voor live imaging tijdreeksen experimenten na receptorendocytose met behulp van een glazen bodem 3,5 centimeter kweekschaal. Breng de schaal over naar een verwarmd podium op de microscoop en begin met beeldvorming met een confocale of turf microscoop. Opstelling voor vaste deksels.
Breng T gelijk aan nul tijdstip deksels over naar een schaal met kamertemperatuur 4% para formaldehyde, 4% sucrose gedurende 20 minuten voor andere tijdstippen. Vervang HBS met geconditioneerd geëquilibreerd 37 graden Celsius medium, en breng terug naar de incubator voor endocytose bij 37 graden Celsius op de benodigde tijdstippen. Haal schalen uit de incubator en was snel twee keer met twee milliliter kamertemperatuur, delcos fosfaat, gebufferde zoutoplossing of DPBS.
Fixeer vervolgens het specimen in 4% paraform aldehyde, 4% sucrose gedurende 20 minuten. Na een 20 minuten fixatie, verwijder 4% paraform aldehyde, 4% sucrose naar de afvalcontainer, en was de schalen twee keer met twee milliliter kamertemperatuur DPBS. Vervolgens incubeer de deksels bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
Een immunofluorescence blok oplossing bevattende 0,2% Triton X 100 om de neuronen te permeabiliseren en anti GFP immunokleuring van de intracellulaire receptorpool en of labeling van andere eiwitten van belang mogelijk te maken. Vervolgens verwijder de permeabele blokoplossing en incubeer de deksels in immunofluorescence blokoplossing zonder Triton X 100 gedurende 20 tot 30 minuten. Voer primaire antilichaam incubaties uit van deksels in blok gedurende enkele uren bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius na incubatie.
Was de deksels door ze gedurende vijf minuten in DPBS te weken voor een totaal van drie wasbeurten. Vervolgens incubeer de deksels met secundaire antilichamen in blokoplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur na één uur. Was de deksels drie keer met DPBS zoals voorheen.
Monteer vervolgens elke deksel door overtollig vocht van de achterkant van de deksel te verwijderen met laboratoriumdoek en draai vervolgens de deksel om op vier microliter montagemedium op een glazen plaat. Voer beeldacquisitie uit met confocale microscopie blind voor experimentele conditie met behulp van een 60 x olie numerieke opening 1,49 immersie objectief.
Gebruik dezelfde beeldacquisitie-instellingen, verwerf enkele Z-sectie beelden met de neuronale cellichaam en verschillende dendritische processen in focus kwantificeer alpha bungalow toxine, Alexa fluorescent signaal en GFP immunokleuring langs 20 micron van drie tot vier proximale dendrieten per neuron met behulp van dezelfde drempel voor analyse van alle endocytosegegevens. Analyseer gegevens van 10 tot 12 neuronen voor elk tijdstip. Herhaal het experiment met verschillende onafhankelijke neuronale culturen.
GABAerge axonen maken remmende contacten op pyramidale neurondendrieten. Pre-synaptische remmende terminalen worden geïdentificeerd door de vesc
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode om de lokalisatie aan het oppervlak en de endocytose van GABAAreceptoren in hippocampale neuronen te meten met behulp van fluorescerende Alexa-kleurstof gekoppeld aan α-bungarotoxine. Deze aanpak maakt analyse van het endocytische transport van eiwitten in het plasmamembraan mogelijk.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
Achtergrond
- GABAA-receptoren spelen een cruciale rol bij de inhiberende neurotransmissie.
- Inzicht in het transport van receptoren is essentieel voor het begrijpen van de synaptische functie.
- Fluorescentielabelingstechnieken verbeteren de visualisatie van receptordynamiek.
Doel van het onderzoek
- Om de lokalisatie en endocytose van GABAA-receptoren in hippocampale neuronen te meten.
- Om α-bungarotoxine te gebruiken voor specifieke labeling van oppervlaktereceptoren.
- Om veranderingen in de receptordynamiek in de tijd te analyseren.
Gebruikte methoden
- Transfectie van hippocampale neuronen met getagde GABAA-receptorondereenheden.
- Labelen van oppervlaktereceptoren met α-bungarotoxine gekoppeld aan fluorescerende Alexa-kleurstof.
- Incuberen van neuronen op verschillende tijdstippen om endocytose mogelijk te maken.
- Fixeren van monsters en uitvoeren van immunokleuring met anti-GFP voor visualisatie.
Belangrijkste resultaten
- Confocale microscopie bracht veranderingen in de lokalisatie van GABAA-receptoren op het oppervlak aan het licht.
- Endocytose van gelabelde receptoren werd in de loop van de tijd waargenomen.
- Zowel gefixeerde als live-imagingbenaderingen werden gebruikt om de receptordynamiek te beoordelen.
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor het analyseren van het transport van GABAA-receptoren.
- Fluorescente labeling met α-bungartoxine is effectief voor het bestuderen van receptordynamiek.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek naar synaptische functie en plasticiteit informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Executives
Deze methode maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van de dynamiek van membraaneiwittransport, wat bijdraagt aan targetvalidatie en mechanische risicoreductie bij de ontdekking van geneesmiddelen in de neurowetenschappen. Door de lokalisatie van receptoren op het oppervlak en de snelheden van endocytose te meten, biedt het voorspellende zekerheid bij het evalueren van modulator-effecten op de receptoromzet. De aanpak helpt bij het prioriteren van verbindingen die het transport van GABAA-receptoren beïnvloeden, een sleutelmechanisme bij therapeutica voor neuropsychiatrische aandoeningen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te kwantificeren hoe liganden en modulatoren de insertie- en verwijderingsnelheden van de GABAA-receptor beïnvloeden.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe meting van de kinetiek van receptortransport in levende neuronen.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen te identificeren die receptor-endocytose of recycling veranderen, wat bijdraagt aan mechanismegebaseerde leadselectie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen (Alexa 594-signaal) die proportioneel zijn aan de receptorniveaus op het oppervlak, wat high-content screening van modulatorbibliotheken mogelijk maakt.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van pHGFP-normalisatie ten opzichte van de totale receptorexpressie, waardoor de variabiliteit tussen wells wordt verminderd en de robuustheid van de assay over neuronale culturen wordt verbeterd.
- Schaalbaarheid: Compatibel met live-imaging en vaste eindpunten, waardoor aanpassing aan multi-well-formaten voor dosis-respons- en tijdreeksanalyse mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert direct de dysregulatie van de GABAA-receptor die betrokken is bij epilepsie, angststoornissen en schizofrenie, ter ondersteuning van studies naar target engagement.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische validatie door receptordynamiek in primaire hippocampale neuronen te meten.
- Risico-geoptimaliseerde besluitvorming: Levert mechanistische gegevens om targets te ontrisken door te bevestigen of testverbindingen de verwachte trafficking-fenotypes produceren voorafgaand aan in vivo testen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie, waarbij assays voor receptortransport inzicht geven in structuur-activiteitsrelaties en het werkingsmechanisme.
- Discovery Biology: Test hoe agonisten, antagonisten of allosterische modulatoren de verblijftijd van receptoren aan het celoppervlak en het endocytische transport beïnvloeden.
- Screening: Levert kwantitatieve, genormaliseerde eindpunten (verhouding oppervlakte- versus totale receptor) die geschikt zijn voor het screenen van effecten van verbindingen op receptordynamiek.
- Analytics: Maakt exponentiële curve-fitting van internalisatiesnelheden over tijd mogelijk, wat kinetische parameters oplevert voor comparatieve profilering van verbindingen.
- Translationeel Onderzoek: Maakt gebruik van hippocampale neuronen — een ziekterevlevant systeem — om CNS-target engagement en modulatie van synaptische inhibitie te modelleren.
- Enterprise Reuse: De α-bungarotoxine-bindingsplaats-tag kan worden overgedragen naar andere ionkanalen of GPCR's, waardoor een herbruikbaar platform wordt gecreëerd voor studies naar het transport van membraaneiwitten.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de behandeling met verbindingen direct te koppelen aan veranderingen in de receptordichtheid op het oppervlak en de endocytische flux.
- Operationele waarde: Standaardiseert metingen van receptortransport via dual-tag normalisatie (Bgt voor oppervlak, pHGFP voor totaal), waardoor de vergelijkbaarheid van gegevens wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig vast te stellen of kandidaten de gewenste receptormodulatie produceren, wat uitval in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van gevalideerde effecten op receptoromzet, een cruciale determinant voor synaptische efficiëntie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neuronale kweek, transfectie en confocale microscopie voor een betrouwbare kwantificering van het eindpunt.
- Is afhankelijk van de toegang tot fluorescent gelabelde α-bungarotoxine (bijv. Alexa 594 conjugaat) en standaard reagentia voor immunofluorescentie.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor temperatuurgecontroleerde incubatie van ligand/receptor en fixatie om reproduceerbare endocytosekinetiek te garanderen.
- Aanpassing aan niet-neuronale cellen kan optimalisatie van de transfectie-efficiëntie en expressieniveaus van het getagde receptorconstruct vereisen.
- Beperkt tot extracellulair toegankelijke epitopen; intracellulaire receptorpools kunnen niet worden beoordeeld zonder aanvullende assays op basis van permeabilisatie.
