Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamica van protonering en conformationele veranderingen van twee fotogevoelige membraaneiwitten te onderzoeken met behulp van tijdopgeloste STEP-scan FTIR-spectroscopie. Dit wordt bereikt door eerst een gehydrateerde eiwitfilm te vormen waarvan de infraroodabsorptie wordt onderzocht, hetzij in een afgezwakte totale reflectieconfiguratie voor bacteriële opsine, of in een transmissieconfiguratie voor kanaal Rodin twee. De tweede stap is het exciteren van het monster met een nanoseconden laserflits van geschikte golflengte om een fotocyclische reactie in het eiwit te initiëren en tijdopgeloste veranderingen in de intensiteit van het infraroodlicht dat met het monster interactieert te detecteren.

Vervolgens wordt het bovenstaande proces herhaald op discrete posities van de mobiele spiegel van een interferometer die de optische padverschil tussen twee gesplitste bundels regelt totdat een complete tijdopgeloste interferogram is opgenomen. De laatste stap is om het tijdopgeloste interferogram om te zetten in een tijdopgeloste IR-verschil in absorptiespectra met behulp van de Fourier-transformatie en de Lambert-Beer wet. Uiteindelijk wordt de tijdsontwikkeling van bannen, vooral in de MI-een en in de CO-dubbele bindingscarboxylaatgebieden, geïnspecteerd om dynamica van conformationele en protoneringsveranderingen in het eiwit te verkrijgen.

Het belangrijkste voordeel van de techniek ten opzichte van de meeste bestaande experimentele methoden is dat het transiente protoneringsveranderingen in eiwitten oplost. Bovendien doet het dit op de micro- en millisecondentijdschalen, het meest relevante tijdsbereik om eiwitfunctionaliteit te onderzoeken. Deze methode kan helpen om sleutelvraagstukken in het veld van moleculaire biofysica en eiwitwetenschap te beantwoorden, zoals welke residuen protoneren en wanneer ze dat doen tijdens het functionele mechanisme van een eiwit of wanneer grote veranderingen in eiwitten plaatsvinden.

Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Victor Ria, onderzoeksassistent uit mijn laboratorium. Eerst monteer de afgezwakte totale reflectie of een TR-accessoire in de monstercompartimente van de FTIR-spectrometer. Meet een breed bereik energiespectrum op vier inverse centimeters. Resolutie van het schone interne reflectie-elementoppervlak door conventionele snelle scan FTIR-spectroscopie bedekt het oppervlak van de A TR met 20 microliters van de hoge ionische sterkte buffer die later wordt gebruikt om het monster te rehydrateren.

Meet vervolgens de IR-absorptie van de buffer. Verwijder vervolgens de buffer en spoel het oppervlak met water zonder het aan te raken. Verwijder de resterende vloeistof door een intense luchtstroom en spreid ongeveer drie microliters van een zes milligram per milliliter eiwitoplossing van bacteriën Rodin in paars membraan op het oppervlak.

Droog de eiwitsuspensie onder een zachte stroom droge lucht tot een film is verkregen. Meet vervolgens het absorptiespectrum van de droge film. Voeg vervolgens voorzichtig 20 tot 40 microliters van de hoge ionische sterkte buffer toe om de droge film te rehydrateren.

Dek de A TR-houder af met een deksel om waterverdamping te voorkomen, meet een absorberend spectrum. Schat het percentage monster dat na rehydratie van de film nabij het oppervlak achterblijft door het absorptiespectrum van de buffer af te trekken. Voeg op dit punt 10 microliters kanaal opsine twee opgelost in decalside in een laag ionische sterkte buffer toe in het midden van een bariumfluoride venster met een diameter van 20 millimeter.

Spreid de oplossing met behulp van de micropipettip uit tot een diameter van zes tot acht millimeter met een zachte stroom droge lucht, warm homogeen film met een diameter die ruwweg overeenkomt met de grootte van de IR-bundel bij de grootste opening. Gebruik vervolgens een platte siliconen O-ring met een dikte van één millimeter. Hydrateer de film door drie tot vijf microliters van een mengsel van glycerol en water verdeeld in drie tot vijf druppels rond de droge film toe te voegen en sluit het stevig met een tweede venster.

Plaats de bariumfluoride sandwichvensters in een houder. Plaats vervolgens de houder in de monstercompartimente. Meet een absorptiespectrum.

Bevestig dat de maximale absorptie in het amide-een gebied in het bereik van 0,6 tot 1,0 is voor de A TR-opstelling. Gebruik een optische vezel geplaatst op de A TR-deksel om de laser aan het monster te koppelen. Pas de energiedichtheid van de laser aan het monster aan op twee tot drie millijoule per vierkante centimeter per puls.

Gebruik een vermogensmeter of de transmissie-experimenten, gebruik spiegels om de laser naar het monster te brengen en indien nodig lenzen om de laserbundel te collimateren of af te leiden tot een diameter iets boven de grootte van het monsterfilm. Synchroniseer de laserpuls met de gegevensregistratie door de Q-switch te gebruiken. Sync out TTL-puls van de elektronica van de neodymium-gedopte atrium-aluminium-granaatlaser om de analoog-digitaal converter van de spectrometer te activeren.

Stel de excitatiesnelheid van de laser in om tijdopgeloste. Stapscanmetingen uit te voeren in het spectrale bereik van 1800 tot 850 inverse centimeter. Plaats een laagdoorlaatfilter in het optische pad dat boven 1.950 inverse centimeter ondoorzichtig is en met goede transmissie onder 1800 inverse centimeter.

Vervolgens verandert u de detector van AC naar DC-gekoppelde modus. Breng op dit punt het DC-niveau van het INTERFEROGRAM naar nul door een stroombias aan de detector toe te passen. Pas de elektronische versterking opnieuw aan om beter gebruik te maken van het dynamische bereik van de analoog-digitaal converter.

Start vervolgens het stapscanmenu van de FTIR-spectrometer. Stel de doelspectrale bandbreedte voor de stapscanmeting in op een achtste van de helium-neonlasergolflengte. Stel de spectrale en faseresolutie in op respectievelijk acht inverse centimeter en 64 inverse centimeter.

Selecteer een appe-functie. Stel vervolgens de INTERFEROGRAM-verwervingsmodus in op enkelzijdige voorwaartse. Stel de bemonsteringssnelheid van de analoog-digitaal converter in op de hoogste beschikbare in de spectrometer.

Stel de trigger voor het experiment in op extern. Stel vervolgens het aantal lineair verdeelde gegevenspunten dat moet worden opgenomen, inclusief 100 pret-triggerpunten. Stel vervolgens het aantal co-edities of