Methoden te karakteriseren Spontane en Schrik-geïnduceerde Locomotion in een-Rotenon geïnduceerde Parkinson's Disease Model van Drosophila
17 augustus 2014
Ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die resulteert uit de degeneratie van dopaminerge neuronen in het centrale zenuwstelsel, waardoor voortbeweging defecten. Rotenone modellen ziekte van Parkinson in Drosophila. In dit document worden twee testen die zowel spontaan en schrikken geïnduceerde motoriek gebreken veroorzaakt door rotenon karakteriseren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de door schrikreactie geïnduceerde en langdurige spontane locomotie in een door rotenone geïnduceerde Parkinson-ziektemodel van drosophila te bepalen, dit wordt bereikt door drosophila op met rotenone gesuppleerd voedsel te kweken om het fenotype te induceren. Als tweede stap worden vliegen onderworpen aan de schrikreactietest en een dubbele fles-apparaat en langdurige spontane locomotietest. In een drosophila-activiteitsmonitor tonen de resultaten aan dat blootstelling aan rotenone locomotiedefectinen veroorzaakt in drosophila op basis van kwantificering van schrikreactie en langdurige spontane locomotie.
Deze methoden kunnen helpen om belangrijke vragen in het veld van drosophila te beantwoorden, modellen van neurodegeneratieve en locomotieve stoornissen, zoals defecten in schrikreactie geïnduceerde locomotie en langdurige spontane locomotie. Om te beginnen, voeg 1,5 gram instant drosophila-medium toe. In een standaard vliegfles vormt het medium met vijf milliliter gedeïoniseerd water dat de juiste dosis rotenone bevat.
Vervolgens sedateer acht tot 12 mannelijke vliegen van één tot drie dagen oud met behulp van koolstofdioxide en transporteer ze naar flessjes met het medicijn. Gesuppleerd voedsel laat vliegen 20 minuten herstellen van sedatie met de fles in een horizontale positie. Plaats vervolgens de fles rechtop in een 12 uur licht-donkere incubator op 25 graden Celsius voor de rest van het experiment.
Keer vervolgens een standaard vliegfles om op een andere fles en verzegel de naad met plakband om een dubbele fles-apparaat te creëren. Verdeel vervolgens de dubbele fles in drie gelijke secties van 6,33 centimeter door cirkels rond de flessjes te markeren met een permanente stift. Na drie dagen van blootstelling aan het medicijn, breng vliegen over in het dubbele fles-apparaat.
Door het plakband over de naad te vervangen, laten vliegen zich 15 minuten aanpassen aan de nieuwe omgeving. Plaats vervolgens de flessjes op een witte achtergrond en zet de digitale camera op. Zorg ervoor dat het hele apparaat in een enkele fotokader zichtbaar is en dat het dubbele fles-apparaat en de timer in beeld zijn en alle vliegen scherp staan.
Markeer de locatie van de camera en de fles om consistente frames tussen proeven te behouden, duidelijk de proefnummer en het medicijnbehandeling in de cameraweergave weergeven. Tik vervolgens stevig drie keer op het dubbele fles-apparaat tegen het aanrecht en zorg ervoor dat alle vliegen naar de bodem van de fles vallen en start onmiddellijk de timer. Maak elke vijf seconden een foto van het apparaat gedurende één minuut.
Laat vervolgens de vliegen een minuut ongestoord herstellen. Herhaal de test nog twee keer met hersteltijden van één minuut tussen elke proef. Bekijk de foto's en noteer het aantal vliegen in elke sectie in de loop van de tijd om de berekeningen te maken. Herstel drie gram instant oph, een medium met 15 milliliter gedeïoniseerd water en de juiste dosis rotenone.
Na vijf minuten plaatst u de buisjes voorzichtig verticaal in doorzichtige flessjes en laadt u het stevige voedsel een centimeter hoog door de buis te draaien. Druk vervolgens voorzichtig de plastic dop op het uiteinde van de buis, vermijd het ontstaan van luchtbellen. Sedateer. Een dag oude mannelijke vliegen met koolstofdioxide en steek voorzichtig één vlieg in elke buis met een penseel.
Vervolgens stopt u het uiteinde van de buis met een kleine katoenen bal. Laat vliegen zich herstellen van koolstofdioxide met de buisjes in een horizontale positie gedurende 15 minuten en zorg ervoor dat alle vliegen levend en actief zijn. Plaats de buisjes in de drosophila-activiteitsmonitor of DAM en controleer of alle buisjes in dezelfde positie ten opzichte van de DAM staan.
Plaats de DAM in een 12 uur licht-donkere incubator op 25 graden Celsius. Verbind vervolgens de DAM met het dataverzamelsysteem. Open vervolgens de DAM-software onder voorkeuren.
Selecteer een startgegevensverzameling van 10 minuten bin-lengte en laat het programma gedurende zeven dagen gegevens verzamelen. Open vervolgens het DAM-bestandscanprogramma en open de monitorgegevens door op selecteer invoergegevens te klikken. Selecteer vervolgens het juiste monitorbereik en stel de bin-lengte in op intervallen van 10 minuten.
Kies vervolgens in het type uitvoerbestand kanaalbestanden en laat alle andere opties op hun standaardwaarden. Klik vervolgens op gegevens scannen en sla de bestanden op in een aangewezen map. Importeer ten slotte gegevens in circadiane gegevensanalysesoftware om tellen per minuut te verkrijgen.
Na drie dagen blootstelling aan verschillende doseringen van roone wild type Canton s-vliegen die aan verhoogde doseringen waren blootgesteld, vertoonden een tekort aan schrikreactie. Een lager percentage vliegen bevond zich in de bovenste sectie en een hoger percentage in de onderste sectie van het apparaat na 30 seconden, wat duidt op een tekort aan saral-reactie, een vergelijkbare trend werd gezien voor vliegen in de spontane locomotietest. Tellen per minuut werd gemeten in de drosophila-activiteitsmonitor of DAM.
Op de vierde dag na blootstelling vertoonden vliegen die werden blootgesteld aan 250 micromolar en 500 micromolar rotenone een significante vermindering in tellen per minuut. Deze tests kunnen gemakkelijk worden aangepast om locomotiedefectinen in andere slokdarmmodellen van ziekten en de werkzaamheid van therapeutische middelen te karakteriseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt locomotiegebreken in een Drosophila-model voor de ziekte van Parkinson, geïnduceerd door rotenon. Het onderzoek richt zich op zowel spontane als door schrik veroorzaakte locomotie, wat inzicht biedt in neurodegeneratieve aandoeningen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Neurodegeneratieve aandoeningen
Achtergrond
- De ziekte van Parkinson wordt gekenmerkt door de degeneratie van dopaminerge neuronen.
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van lokomotiedefecten.
- Rotenone wordt gebruikt om Parkinson-achtige symptomen bij deze vliegen op te wekken.
- Inzicht in de lokomotie kan leiden tot een beter begrip van de mechanismen van neurodegeneratie.
Doel van de studie
- Om schrik-geïnduceerde voortbeweging bij Drosophila te beoordelen.
- Om langdurige spontane voortbeweging in een rotenon-geïnduceerd model te evalueren.
- Om de impact van rotenon op het voortbewegingsgedrag te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Drosophila werden gekweekt op voeding aangevuld met rotenon.
- De vliegen ondergingen een schrikreactietest.
- Een dubbel flaconapparaat werd gebruikt voor de beoordeling van de locomotoriek.
- Langdurige spontane locomotoriek werd gemeten met een Drosophila-activiteitsmonitor.
Belangrijkste resultaten
- Blootstelling aan rotenon leidde tot significante locomotorische defecten.
- Kwantificering onthulde een verminderde door schrikreactie geïnduceerde locomotie.
- Ook de langdurige spontane locomotie werd beïnvloed door blootstelling aan rotenon.
- Deze bevindingen dragen bij aan het begrip van locomotorische stoornissen in neurodegeneratieve modellen.
Conclusies
- De studie biedt een kader voor het beoordelen van de locomotie in Drosophila-modellen van de ziekte van Parkinson.
- De resultaten benadrukken het nut van rotenon bij het bestuderen van neurodegeneratieve aandoeningen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methoden om verdere neurobiologische vragen te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de industrie
Deze studie biedt een schaalbare high-throughput benadering om locomotorische tekortkomingen te kwantificeren in een Drosophila-model voor de ziekte van Parkinson, wat vroege validatie van targets en mechanische risicoreductie voor therapeutica tegen neurodegeneratie mogelijk maakt. Door zowel spontane als schrikreactie-geïnduceerde bewegingsfenotypes vast te leggen, ondersteunen de assays het voorspellende vertrouwen in pathway-modulatie en fenotypische screeningscampagnes. De methodologie biedt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische evaluatie, wat een risicogebaseerde prioritering van verbindingen die de integriteit van dopaminerge neuronen en de mitochondriële functie beïnvloeden, faciliteert.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk met betrekking tot het overleven van dopaminerge neuronen en de remming van mitochondriaal complex I.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor de verduidelijking van signaalpaden en biologische risicoreductie van mitochondriale targets.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van de portfolio door verbindingen die de locomotorische functie herstellen te onderscheiden van verbindingen die geen effect hebben op de door rotenon geïnduceerde deficiënties.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gevalideerde biologische systemen voor downstream verbindingsevaluatie in screenings gericht op neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en high-throughput compatibiliteit via een dubbel vial-apparaat en een Drosophila-activiteitsmonitor.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over meerdere rotenonedoseringen en genetische achtergronden voor consistente locomotorische fenotypering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door rotenon-geïnduceerde oxidatieve stress en locomotorische achteruitgang te modelleren, parallel aan de progressie van de ziekte van Parkinson bij mensen.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale tracking van spontane locomotie over zeven dagen mogelijk om chronische effecten van verbindingen te beoordelen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door acute schrikreacties en langetermijnactiviteit te koppelen aan neurodegeneratieve mechanismen.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door locomotorische baselines vast te stellen vóór compound-screening en wordt voortgezet in lead-optimalisatie voor bevestiging van het werkingsmechanisme.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van mitochondriële dysfunctie en oxidatieve stresspaden bij neurodegeneratie.
- Screening: Levert kwantitatieve, op bins gebaseerde locomotie-outputs die geschikt zijn voor geautomatiseerde beeldanalyse en dosis-responsprofilering.
- Analytics: Genereert tellingen per minuut en positionele distributiegegevens die statistische vergelijking van behandelingseffecten over tijd mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt acute schrikdefecten en chronisch verlies van spontane activiteit met de progressieve motorische achteruitgang die wordt gezien in preklinische modellen.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar platform voor locomotorische fenotypering dat aanpasbaar is aan andere Drosophila-ziektemodellen en testen van therapeutische effectiviteit.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanische ambiguïteit in locomotorische fenotypes te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria door gedefinieerde tapping-protocollen, herstelintervallen en beeldvormingsparameters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, kwantificeerbare biomarkers van neuronale integriteit en mitochondriële functie te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering mogelijk van verbindingen die de door rotenone geïnduceerde locomotorische achteruitgang beïnvloeden, waardoor het risico op falen in een late fase wordt verminderd.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, sedatie en het opzetten van gedragsassays.
- Afhankelijk van de beeldvormingsinfrastructuur (digitale camera, verlichting) en Drosophila-activiteitsmonitorsystemen voor gegevensverzameling.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor het markeren van vials, de tikkracht en de hersteltijd om consistentie tussen de assays te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het uitbreiden van assays naar verschillende genetische achtergronden of omgevingscondities.
- Beperkt door de noodzaak van handmatige beeldbeoordeling bij schrikassays, tenzij automatische tracking wordt geïmplementeerd.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Startle-induced Locomotion Assay and Setup
3:11
Startle-induced Locomotion Experimentation and Data Analysis
4:04
Spontaneous Locomotion Assay Setup
5:19
Spontaneous Locomotion Data Collection and Analysis
6:36
Results: Rotenone-induced Response Deficiency
7:35
Conclusion
