Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door Entamoeba histolytica Infectie

Het algemene doel van deze procedure is om vroege gastheer-pathogeen interacties en het invasiepotentieel van TBA.Histolytica te beoordelen. Maak eerst bereidingen van de intacte trobozoieten, de trobozoieten, totale lysaten of de gesecreteerde trobozoieten. Vervolgens incubeer gastheer-epitheelcellen met geschikte concentraties van de verschillende trobozoieten.

Nu gebruikmakend van AM-immunofluorescence, analyseer de behandelde epitheelculturen voor geselecteerde ABA histolytica-eiwitten die interageren met de strakke verbindingen van de epitheelcellen, meet ook veranderingen van de paracellulaire barrière door trans-epitheel elektrische weerstand. Samen kunnen de resultaten aantonen dat strakke verbindingen worden ontmanteld door TBA Histolytica, en ook de betrokkenheid van de geselecteerde complexen in dit proces aangeven. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn het gebruik van verschillende producten van de parasiet om de translocatie van Eva histo-factoren naar het gastheer-epitheel te evalueren, evenals om de deelname van deze eva te aantonen.

His-factoren bij het openen van de verbinding van hele cellen in zeer vroege infectietijden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het amoebeen-veld, zoals het begrijpen van de moleculaire interacties tussen epitheel en de amoebeen-parasiet. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat ze niet de geschikte incubatietijden kennen, de verhouding van de twee celtijden voor co-incubatie, en ook hoe ze de verschillende ELI-producten kunnen verkrijgen en hoe ze TER kunnen meten.

De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot onze therapie van amis omdat deze vir-factoren, zoals het E-H-C-P-A-D-H 112 complex, kunnen worden gebruikt als doelen in nieuwe behandelingsstrategieën. Deze in vitro-methode kan inzicht geven in de deelname van Anica-viraal factor in de initiële ziekenhuissite-interactie. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals inbivo, infectiemodellen in hamstermuizen, cavia's en ook in humane darmbiopsies. Cultuur.

De MDCK-cellen in 10 milliliter gecomplementeerd DMEM-medium bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Laat één maal 10 tot de vijfde trobozoieten van vent-amoeba histolytica authentiek groeien in 15 milliliter TYIS 33-medium bij 37 graden Celsius. Om de trobozoieten los te maken, koel de buis gedurende vijf tot 10 minuten in een ijswaterbad.

Breng vervolgens de cultuur aseptisch over in een conische buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 360 keer G bij vier graden Celsius. Decanteer nu voorzichtig de supernatant. Voeg ijskoud PBS toe aan het pellet en draai de buis verschillende keren om de cellen na centrifugatie te verspreiden.

Bepaal het aantal trobozoieten met behulp van een hemo cytometer om de trobozoieten snel te vriezen in vloeibaar stikstof gedurende één minuut, ontdooi bij vier graden Celsius en vortex krachtig. Activeer nu de proteasen die aanwezig zijn in de lysaten met 0,02% beta mercaptoethanol. Verdun negen maal 10 tot de zesde trobozoieten in drie milliliter ijskoud PBS en breng de cellen over in een 50 milliliter conische buis.

Plaats nu de tropho-suspensie op een vijf graden scheef horizontaal hoek in een 37 graden Celsius-incubator gedurende twee uur om de gesecreteerde producten te verzamelen, centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 360 keer G. Gebruik een wegwerp- en steriele spuit om voorzichtig het supernatant te verzamelen, vermijd contaminatie van de monsters met trobozoieten uit het pellet. Om vervolgens eventuele overgedragen cellen te elimineren, laat het supernatant door een 0,22 micron celluloseacetaatmembraan passeren.

Activeer nu de proteasen met 0,02% beta mercaptoethanol voor immunofluorescence-cultuur. De MDCK-cellen op steriele glazen deksels binnen een 24-multi-well-celcultuurschaal. Inspecteer de cellen op de omgekeerde microscoop totdat ze 100% confluentie bereiken.

Voeg de verschillende omstandigheden van trobozoieten toe, verdund in één milliliter warm PBS. Bevat de controleomstandigheden van MDCK-cellen met PBS en geen e histolytica, evenals MDCK-cellen met de verschillende omstandigheden van trobozoieten, maar zonder incubatie met primaire antilichamen. Plaats de cultuurplaat in de incubator gedurende twee of 30 minuten.

Was vervolgens de epitheelcellen vijf keer met koud PBS om ongebonden moleculen of trobozoieten te elimineren. Fixeer en perme de cellen met één milliliter 96% ethanol gedurende minuten bij min 20 graden Celsius in een vochtige kamer. Haal de deksels voorzichtig uit de putjes.

Verwijder overtollig vocht van de rand met filterpapier en dompel de deksel met de cellen naar beneden in een 0,5% BSA-blokkeeroplossing. Incubeer de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen een mengsel van primaire antilichamen in PBS voor.

Til de deksels uit de blokkeeroplossing. Droog eventueel overtollig vocht op filterpapier. Breng de cellen over in de antilichaamoplossing en incubeer de monsters een nacht bij vier graden Celsius.

Was de cellen vijf keer met één milliliter PBS om ongebonden moleculen te verwijderen. Bereid nu een mengsel van de twee fluorescerende secundaire antilichamen in PBS voor. Incubeer de monsters in secundaire antilichamen gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker voor nucleaire kleuring.

Incubeer de cellen gedurende drie minuten met 200 microliter 0,05 millimolair dappy-oplossing bij kamertemperatuur in het donker. Analyseer nu de bereidingen door middel van confocale microscopie door Zack-secties en XZ-vlakken in co-incubatie-experimenten. Gebruik proteaseremmers of een specifiek antilichaam, incubeer elke experimentele conditie gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius met proteaseremmers of een monoklonaal antilichaam-cultuur.

MDCK-cellen op steriele transwell-doorlaatbare ondersteuningen in het bovenste compartiment, plaats 100 microliter van de cellulaire suspensie en in het onderste compartiment plaats 600 microliter aangevuld D