Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in Xenopus laevis

Het algemene doel van deze procedure is om de visuele functie van kikkervisjes te testen door de hoeveelheid tijd die het dier doorbrengt op de helft van de testtank die bedekt is met zwart, te registreren. Dit wordt bereikt door eerst kikkervisjes te laten groeien tot stadia 45 tot 50. De tweede stap is het opzetten van een half zwarte, half witte tank samen met een camera voor de gedragstest.

Plaats vervolgens een tweede tank met een kikkervisje in de buitenste tank. Voor elk kikkervisje wordt het door zicht geleide gedrag opgenomen terwijl de achtergrond in zijn omgeving verandert. De laatste stap is om een retinale ex-sodomie uit te voeren op de kikkervisjes en vervolgens de gedragstest te herhalen.

Uiteindelijk worden gegevens van deze eenvoudige, goedkope test gebruikt om aan te tonen dat de kikkervisjes een voorkeur hebben om aan één kant van de tank te zwemmen in plaats van de andere, onder tests van fototop-visie. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze methode boven andere technieken zoals de optische kinetische respons of de staartflip-test, is dat het een goedkope, eenvoudige methode is die apparatuur gebruikt die in de meeste laboratoria gemakkelijk beschikbaar is. Om de kikkervisjes voor te bereiden, verkrijg eerst bevruchte xenopus-embryo's, plaats mark's, gemodificeerde ringers of MMR verdund met een factor 10 in 60 millimeter Petri-schotels met 50 microgram per milliliter.

Gentamicine-antibioticum plaats blastula tot neurale plaatstadium embryo's. Stadia twee tot 15 bij 18 graden Celsius in de Petri-schotels. Zodra embryo's een nieuwe kuip in favorstadium van ongeveer 27 tot 30 bereiken, schakel ze over naar 0,1 XMMR zonder antibiotica om groei van darmbacteriën mogelijk te maken.

Wanneer de kikkervisjes de voedingsfase rond stadium 45 bereiken, verplaats ze naar 100 millimeter Petri-schotels met 0,1 XMMR. Voer ze de volgende dag netelpoeder supernatant. Na een week in de 100 millimeter Petri-schotel, vul een halve gallon tank met kikkerwater.

Verplaats de dieren naar de tank en zet het netelpoeder supernatant-voedingsschema voort, maar ververs het water slechts twee tot drie keer per week. Wanneer de dieren in halve gallon tanks zitten, houd ze vast in een cyclus van 12 uur licht, 12 uur donker met verlichting die om 6:00 uur 's ochtends aangaat. Plaats de halve gallon tank met de proefpersonen voorafgaand aan de test gedurende ten minste 12 uur op een wit oppervlak. De gedragstest moet worden uitgevoerd in een rustige, laagverkeersgebied met standaard fluorescentie verlichting.

Bereid twee nestelende halve gallon testtanks voor op de buitenste hoeken van wat de binnenste tank zal zijn. Gebruik een Sharpie om de waterlijn op vijf centimeter boven de bodem te markeren. Identificeer ook voor de binnenste tank eventuele uitsparingen in het interieur.

Vul deze met een inert samenstel om te voorkomen dat kikkervisjes erin blijven hangen. Richt nu de aandacht op de tweede buitenste tank. Voor de volgende stap, verkrijg zwart elektrisch plakband en wit tissuepapier.

Gebruik het plakband om de buitenkant van de ene helft van de tank te bedekken en het tissuepapier om de buitenkant van de andere te bedekken zoals hier getoond. Zodra de tanks zijn voorbereid, zet een inoculatieturntable op en plaats de geneste tanks erop. Plaats een statief en webcam zodat de camera de binnenkant van de tanks van boven kan afbeelden.

Verbind de webcam met een computer met videoopname- en afspeelsoftware. Zet de camera aan en bereid je voor om een nieuwe filmopname te maken. Bedek vervolgens de camera en tanks met een lichtgewicht katoenen doek.

Om externe signalen aan de kikkervisjes te verminderen, gebruik een helderheidsmeter en controleer of de helderheid onder de doek tussen de 35 tot 50 kaarsen per vierkante meter is. Start de gedragstest door de binnenste testtank op te halen. Vul deze met kikkerwater tot de vijf centimeter markering.

Gebruik een net om een dier van zijn halve gallon container naar de binnenste testtank bij de computer over te brengen. Zorg ervoor dat de opnamesoftware open is en het testgebied opneemt voor registratie. Schrijf de naam van het dier, de datum en het tijdstip op een stuk papier.

Plaats dit onder de camera voor opname. Nadat dit is gebeurd, stel een timer in op twee minuten. Orienteer vervolgens de buitenste tank op de turnable, zodat de zwarte kant aan de rechterkant staat.

Plaats nu de testtank in de buitenste tank. In het opnamegebied, sluit de drape en gebruik het computerscherm om de oriëntatie van de buitenste tank te controleren. Zorg ervoor dat video wordt opgenomen en start de timer.

Wanneer de timer piept, houd de drape op zijn plaats en verwijder de binnenste testtank. Draai vervolgens de buitenste tank 180 graden zodat de zwarte kant nu aan de linkerkant staat. Plaats de testtank terug in de buitenste tank en start de twee minuten timer.

Verwijder opnieuw de binnenste tank. Draai de buitenste tank 180 graden en vervang de binnenste tank elke twee minuten voor een totaal van 10 keer. Wanneer je klaar bent, stop de video-opname.

Breng het kikkervisje terug naar zijn halve gallon tank. Bereid een microscoop voor om de retinol ex-sodomie uit te voeren. Vul een 60 millimeter Petri-schotel met 1%aros gesmolten in 0,1 XMMR en laat het stollen.

Verwijder een klein rechthoekig stukje van de aros ter grootte van het kikkervisje. Wanneer je klaar bent om verder te gaan, haal het proefdier op en plaats het in 0,02%Trica. Ga verder wanneer het niet reageert op een staartprik met nummer drie forceps.

Breng vervolgens het dier over naar de schotel. Ga verder door de Petri-schotel op de microscoop te monteren. Bereid je voor om het dier met forceps aan één kant te ondersteunen.

Aan de andere kant gebruikt u een 25 gauge naald om de huid achter de dorsale regio van het oog in een hoek van 45 graden te doorboren, reik voorzichtig met nummer vijf forceps in het gat en knip de oogzenuw af terwijl u