Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen
8 augustus 2014
Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.
Het algemene doel van deze procedure is om thymische epitheelcellen of tech te isoleren, identificeren en zuiveren. Dit wordt bereikt door de thymus eerst enzymatisch te verteren en mechanisch te verstoren om de tech te dissociëren in een enkele celsuspensie. Vervolgens kan de tech worden geanalyseerd door flowcytometrie of verrijkt via een panning-strategie.
Uiteindelijk kunnen thymische epitheelsubpopulaties worden gezuiverd door middel van fluorescentie geactiveerde celsortering. Deze methode kan helpen om veel belangrijke vragen op het gebied van T-celontwikkeling te beantwoorden, zoals: hoe bevorderen thymische epitheelcellen thymische selectie? Wat veroorzaakt thymische disfunctie bij oudere dieren en hoe kunnen we T-celreconstitutie in vitro bereiken?
De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de hoge herstel van variabele emmische kiemcellen, de onbevooroordeelde verrijking van de emmische epitheelcellen en de hoge zuiverheid die uiteindelijk kan worden bereikt door celsortering. Om thymische stromale cellen te isoleren, identificeer eerst de thymus, die net onder de ribben ligt en eruitziet als twee dunne witte lobben boven het hart. Vervolgens ontkoppelt u het bindweefsel rond de thymus en gebruikt u gebogen gekartelde forceps om voorzichtig de thymische lobben los te trekken en te verwijderen.
Plaats de lobben in een zes-putjesplaat met vijf milliliter medium en verwijder eventueel omliggend vet en bindweefsel. Breng vervolgens de bijgesneden lobben over naar een nieuwe put met vijf milliliter vers bereide enzymoplossing en maak met fijne schaar kleine incisies in het weefsel. Plaats de plaat in een incubator van 37 graden Celsius.
Na 20 minuten pipetteert u het weefsel voorzichtig een paar keer op en neer met een vijf milliliter pipette om de slurry te dissociëren in een enkele celsuspensie. Verzamel de supernatantfractie in een 50 milliliter buis met 10 milliliter koude albuminerijke buffer op ijs om de enzymen te neutraliseren. Voeg vervolgens 2,5 milliliter enzymoplossing toe aan het resterende weefsel.
Incubeer de plaat gedurende 15 minuten. Daarna schudt u het weefsel voorzichtig met een drie milliliter spuit voorzien van een 18-gen naald om eventuele aggregaten te breken. Breng vervolgens het over naar de opvangbuis.
Voeg vervolgens 2,5 milliliter enzymoplossing toe aan het resterende weefsel. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten. Na de derde incubatie herhaalt u de mechanische agitatie met een 20 5G-naald.
Nadat u het weefsel gedurende een laatste vijf tot tien minuten heeft geïncubeerd, brengt u het supernatant over naar de opvangbuis voor centrifugatie om de herstelde tech te identificeren door flowcytometrie. Volg standaard antilichaamkleuringsprocedures, laat de monsters lopen op een multiparameter flowcytometer en analyseer de gegevens met behulp van de juiste faxanalysesoftware om de tech verder te verrijken door de panning-methode. Incubeer eerst de cellen met het juiste antilichaam voor de verrijking. Voeg vervolgens de celsuspensie toe aan een vooraf gecodeerde panningplaat en draai de plaat vervolgens rond en incubeer op kamertemperatuur.
Na 30 minuten draait u de plaat krachtig rond en brengt u het supernatant over naar een kegelbuis. Spoel de plaat twee keer af met vers medium en verzamel de wasbeurten in de opvangbuis. Na het centrifugeren van de cellen, resuspendeert u het pellet in vijf milliliter vers medium en brengt u de celsuspensie over naar een nieuwe panningplaat, waarbij u de cellen verzamelt na het ronddraaien en incuberen zoals zojuist is gedemonstreerd om de verrijkte tech verder te zuiveren in hun thymische celsubpopulaties.
Na het labelen met de juiste antilichamen, sorteert u de tech door een 100 micrometer mondstuk door middel van fluorescentie geactiveerde celsortering en verzamelt u de cellen in 30% volume per volume FBS in medium. In deze representatieve gatingstrategie voor het identificeren van tech door flowcytometrie kan de expressie van epca, maar niet CD 45 door de tech worden waargenomen. Daarom kan tech worden gesorteerd op basis van hun ep, camm en CD 45 expressie. Tech bestaat uit corticale of CEC en medullaire of mtech thymische epitheelsubpopulaties.
Deze subpopulaties kunnen worden onderscheiden door het live 51 antilichaam, dat G glutamyl aminopeptidase herkent die wordt geexpresseerd door ctec en de lectine UEA een, die bindt aan mtech. Zowel ctech als Mtech drukken MHC Klasse twee uit op hun oppervlakken. Hoewel mtech verder kan worden onderverdeeld in mtech laag en mtech hoog populaties, afhankelijk van hun niveau van MHC twee expressie, kan ongeveer acht keer meer tech worden teruggewonnen met behulp van het zojuist gedemonstreerde liase-enzymgebaseerde protocol vergeleken met een protocol met collageenase en schijfruimte met ongeveer negen keer 10 tot de vijfde, terug te winnen uit slechts een muis thymus om de sorteertijd te verkorten en de levensvatbaarheid van de teruggewonnen stromale cellen te verhogen. Panning kan worden gebruikt zoals zojuist is gedemonstreerd om de thymocytensites te verminderen in vergelijking met volledige bereide thymuscellen.
De verhouding van tech neemt toe van minder dan 0,5%tot meer dan 15%in de post-verrijkte celpopulatie. Na het panning, zijn de verhoudingen van de tech subpopulaties niet veranderd, wat suggereert dat geen van beide subpopulaties selectief verloren gaat tijdens het panning. In vergelijking met het voorbereidende verrijkingsmonster, is de herstelratio van tech ongeveer 85%. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de mic germ cellen kunt verrijken van meer dan door panic, evenals hoe u meer themic epitheelsubpopulaties kunt identificeren en zuiveren door middel van flowcytometrie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor de isolatie, identificatie en zuivering van thymische epitheelcellen (TECs) van muizen. Het protocol is ontworpen om studies naar thymusfunctie, T-celontwikkeling en thymische dysfunctie te faciliteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Thymusfunctie
Achtergrond
- Thymusepitheelcellen spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van T-cellen.
- Inzicht in TEC's kan leiden tot een beter begrip van de processen van thymische selectie.
- Thymische dysfunctie is geassocieerd met veroudering en diverse ziekten.
- Reconstitutie van T-cellen is essentieel voor therapeutische strategieën.
Doel van de studie
- Om TECs te isoleren en te zuiveren voor gedetailleerde analyse.
- Om de mechanismen van thymusselectie te onderzoeken.
- Om de oorzaken van thymusdisfunctie bij veroudering te verkennen.
Gebruikte methoden
- Enzymatische digestie en mechanische disruptie van de thymus.
- Flowcytometrie voor analyse van TEC's.
- Panning-strategie voor verrijking van TEC's.
- Fluorescentie-geactiveerde cel sortering voor zuivering van TEC-subsets.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en zuivering van TEC's.
- Identificatie van belangrijke TEC-subsets betrokken bij de ontwikkeling van T-cellen.
- Inzichten in thymische selectiemechanismen.
- Potentiële implicaties voor therapieën voor T-celreconstitutie.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het bestuderen van TEC's.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de thymusfunctie en thymusdysfunctie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit protocol om de T-celontwikkeling te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het isoleren van zeldzame stromale populaties, zoals thymusepitheelcellen, maakt het mogelijk om mechanistische risico's van hypothesen over T-celontwikkeling te minimaliseren en ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van immunotherapiedoelen. Deze methode biedt een ziekterellevant systeem voor het bestuderen van thymuselectie en dysfunctie, wat direct bijdraagt aan het ontwerp van preklinische modellen en de ontdekking van translationele biomarkers. Door de recovery en levensvatbaarheid van zeldzame cel-subsets te verbeteren, wordt biologische ambiguïteit in de vroege ontdekkingsfase verminderd en worden beslissingen over portfolio-triage verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de functie van thymusepitheelcellen in de commitment- en selectiepaden van T-cellen.
- Operationele waarde: Maakt onbevooroordeelde verrijking van zeldzame TEC's uit de muizenthymus mogelijk, waarbij de opbrengst ongeveer achtmaal hoger is dan bij methoden op basis van collagenase.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door multiparametrische flowcytometrie-identificatie van corticale en medullaire TEC-subsets mogelijk te maken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gezuiverde TEC-subsets die geschikt zijn voor functionele downstream-assays, zoals genexpressieprofilering en Western blot.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd voor cel sortering en minimaliseert het verlies aan levensvatbaarheid door thymocyten-depletie via panning voorafgaand aan FACS.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde preparatie van enkelcel-suspensies uit thymisch stroma mogelijk voor reproduceerbare immunologische assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelevante systeemmodellering van thymische dysfunctie bij veroudering en studies naar immuunreconstitutie.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door gezuiverde TEC's te leveren voor in vitro T-celreconstitutie.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk van targets die betrokken zijn bij thymische selectie en T-celontwikkelingspaden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekkingsbiologie naar lead-identificatie door gevalideerde stromale inputs te leveren voor immunologische target-beoordeling en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van de rollen van thymusepitheel bij positieve en negatieve T-celselectie via isoleerbare, analyseerbare subsets.
- Screening: Levert assay-klare, gezuiverde TEC-populaties met een verbeterde recovery en verkorte sorteertijd voor screening van verbindingen of modulatoren.
- Analytics: Maakt kwantitatieve multiparameter flowcytometrie en moleculaire profilering (PCR, Western blot) mogelijk voor een objectieve vergelijking van TEC-toestanden.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische T-celreconstitutiemodellen door gezuiverde TEC's te leveren die in staat zijn om lymfoïde ontwikkeling in vitro te ondersteunen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbare, gestandaardiseerde workflow voor het isoleren van zeldzame thymische stromale cellen, toepasbaar binnen immunologie- en immunotherapie-ontwikkelingsprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in T-celontwikkelingsmodellen door betrouwbare isolatie en karakterisering van zeldzame TEC-subsets mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via enzymatisch-mechanische dissociatie en panning-gebaseerde verrijking voorafgaand aan FACS.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door de validatie van targets in thymus-afhankelijke immunologische pathways te verbeteren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistische inzichten te bieden in thymische selectie en crosstalk tussen stroma en immuunsysteem.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in enzymatische weefseldissociatie, flowcytometrie-kleuring en fluorescence-activated cell sorting.
- Afhankelijk van toegang tot celcultuurincubators, centrifuges, flowcytometers en panning-platen gecoat met geschikte substraten.
- Necessiteert standaardisatie van enzymatische digestietijden en mechanische agitatiestappen om een consistente kwaliteit van de enkelcel-suspensie te waarborgen.
- Vereist aanpassingen bij toepassing op verschillende muizenstammen, leeftijden of ziektemodellen die de thymische cellulariteit en stromale compositie beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten de zeldzaamheid van TECs, waardoor verrijkingsstappen noodzakelijk zijn, en de noodzaak voor zorgvuldige instandhouding van de levensvatbaarheid tijdens langdurige sorting.
