Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en hun locatie, beweging en dynamische associatie in supramoleculaire complexen te analyseren. Dit wordt bereikt door snap-getagde receptoren op zeer lage niveaus op het oppervlak van levende cellen te exprimeren en ze te labelen met heldere organische fluoroforen om detectie van enkele moleculen mogelijk te maken. Als tweede stap worden cellen gevisualiseerd door totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie, die het mogelijk maakt om een snelle beeldsequentie van individuele receptordeeltjes te verkrijgen die zich op het celoppervlak bewegen.

Vervolgens worden geautomatiseerde detectie- en volgalgoritmen toegepast op de beeldsequentie om de positie en intensiteit van elk receptordeeltje in de loop van de tijd te verkrijgen. Resultaten worden verkregen die een nauwkeurige analyse laten zien van de grootte van receptorcomplexen in dit voorbeeld, bèta-twee adrenerge receptoren op basis van een gemengde Gaussische fitting van de intensiteitsverdeling van de deeltjes aan het begin van de beeldsequentie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van celbiologie, zoals hoe onze receptoren zich organiseren in domeinen van het oppervlak van levende cellen.

Hoe ze met elkaar interageren om dimeren en oligomeren te vormen, en hoe dynamische gebeurtenissen aan de basis van receptorsignalering daadwerkelijk plaatsvinden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven standaard biochemische en microscopiemethoden is dat het het gedrag van enkele receptoren in de natuurlijke omgeving onderzoekt, waardoor we belangrijke aspecten kunnen bestuderen die typisch verborgen zijn in ensemblemetingen. De deksels voor de monsters moeten grondig worden gereinigd om achtergrondfluorescentie te minimaliseren. Tijdens het beeldvormen, gebruik schone pincetten om een diameter van 24 millimeter te plaatsen.

Glazen deksels in een dekselhouder die afzonderlijke deksels scheidt. Doe de houder met deksels in een beker en voeg chloroform toe totdat de deksels bedekt zijn. Bedek de beker met aluminiumfolie om verdamping te verminderen en soniceer in een bad.

Soniceer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Haal na een uur de dekselhouder uit de beker en laat de deksels drogen. Plaats vervolgens de houder met de deksels in een andere beker en voeg vijf molaire natriumhydroxideoplossing toe totdat de deksels bedekt zijn.

Zoals eerder, bedek de beker met folie en soniceer gedurende een uur bij kamertemperatuur, breng de dekselhouder over in een nieuwe beker en was drie keer met gedestilleerd water. Leg ten slotte de gereinigde deksels in een glazen celkweekschaal gevuld met 100% ethanol. Hier worden deksels voor en na het schoonmaken getoond, geïmageerde door totale interne reflectiefluorescentie of turf-microscopie.

Cal-kalibratiemonsters worden gebruikt om de intensiteit van enkele fluorescerende moleculen tijdens turf-microscopie te schatten. Om de monsters voor te bereiden, lost u de fluorescerende kleurstof op in het juiste oplosmiddel. Bereid een een-op-tien serieverdunning van de fluorescerende kleurstof variërend van één picaMolar tot één ano molair.

In filtergesteriliseerde water. Was de eerder gereinigde deksels door ze over te brengen naar een celkweekschaal gevuld met filtergesteriliseerde water. Plaats vervolgens elke deksel in een putje van een zes-putjes celkweekplaat en wacht tot ze drogen. Spot 20 microliters van elke fluorescente kleurstofverdunning op een aparte gereinigde deksel.

Laat de deksels drogen onder een steriele kap. Bescherm de deksels tegen licht en stof tot gebruik voorafgaand aan transfectie. Bereid een zes-putjes celkweekplaat voor. Was de gereinigde deksels met steriele PBS en plaats één deksel in elk putje van de zes-putjes celkweekplaat.

De CHO-cellen die voor dit onderzoek worden getransfecteerd, worden gekweekt bij 37 graden Celsius in 5% CO2 in één, een-op-één ECCOs gemodificeerd arendskruitkweekmedium F 12 aangevuld met 10% foetaal runderserum penicilline en streptomycine na trypsinisatie en het tellen van de cellen volgens standaardmethoden gezaaid bij een dichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per putje. In de zesde celkweekplaat met deksels, laat de cellen 24 uur groeien in een incubator om ongeveer 80% confluentie te bereiken, wat de optimale celdichtheid is. Voor transfectie.

Het moeilijkste aspect van dit protocol is om een extreem laag expressieniveau van membraanreceptoren op het celoppervlak te bereiken om succes te garanderen. De transfectievoorwaarden. Bijvoorbeeld, de hoeveelheid plus media NA en tijd na transfectie moet worden geoptimaliseerd Op de dag van transfectie.

Bereid de transfectiereagentia voor voor elke zal twee microgram van de gewenste plaid DNA verdunnen in 500 microliters optimum medium in een andere buis. Voor elke put verdun zes microliters van Lipectomy 2000 in 500 microliters van Optum medium. Incubeer beide buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Na vijf minuten, combineer beide oplossingen in één buis en meng om een transfectiemengsel te verkrijgen. Incubeer het transfectiemengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de CHO-cellen voor.

Was de cellen twee keer met voorgewaarschuwde PBS Na de tweede wasbeurt, vervang PBS met één milliliter per putje van fenolroodvrij D-M-E-M-F 12 medium aangevuld met 10% FBS, maar zonder antibiotica. Voeg één milliliter van het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan elke put en schud de plaat voorzichtig heen en weer om volledige menging te garanderen. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5% CO2 gedurende twee tot vier uur voordat u onmiddellijk doorgaat naar de eiwitlabeling.

Om deze procedure te beginnen, verdun één microliter van de fluoro-vier geconjugeerde benzo guine derivaat- of fluoro-vier BG-stockoplossing In één milliliter van D-M-E-M-F 12 medium aangevuld met 10% FBS om een eindconcentratie van één micromolar te verkrijgen. Haal de getransfecteerde cellen uit de incubator en was twee ke