Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

Het algemene doel van de volgende experimenten is om DNA en eiwitten specifiek te labelen met behulp van methyl transferases, die op natuurlijke wijze de geactiveerde methylgroep en de cofactor Sile l methionine genaamd aome naar D-N-A-R-N-A overbrengen. Eiwitten of kleine biomoleculen. Eenstaps labelen wordt bereikt door de natuurlijke cofactor om te vervangen door synthetische aine cofactoren die de loop van de reactie veranderen, wat leidt tot enzymatische koppeling van de gehele cofactor en dus covalent labelen van de substraatsequentie. Specifiek methyl transferase-geïnduceerd labelen van DNA wordt gedemonstreerd met de adine specifieke DNA methyl transferase, M-B-S-E-C een, die de biotinyleerde Aine cofactor zes BAZ koppelt aan de A-G-C-G-A-T herkenningssequentie, wat leidt tot sequentie, specifiek biotinyleerde, DNA methyl transferase-gestuurde overdracht van geactiveerde groepen is het gebruik van labeleiwit en wordt gedemonstreerd met MTA's set zeven negen, die een pro pargo groep overbrengt van C acht oin naar lysine vier van histone H drie.

Het gealkyleerde lysine residu wordt chemisch gelabeld door een azi-gemodificeerde Fluor met behulp van kopergekatalyseerde click-chemie, waardoor specifiek gelabeld eiwit ontstaat. Een voordeel van het gebruik van meth transferases voor labelen is dat ze het potentieel hebben om direct native substraten te targeten. Ik zal dit demonstreren door sequentiespecifiek bioTE elatie van plasmide, DNA Meth transferase, gekatalyseerde eiwijtmodificatie met de cofactor analoog zin en maakt de introductie van een grote verscheidenheid aan reportergroepen in twee stappen mogelijk.

Ik zal dit demonstreren door middel van fluorescentielabeling van het proteïne hisone H drie en het tonen van resultaten van het labelen van H drie met biotin. Bovendien kunnen dubbel geactiveerde cofactor run analogen eenvoudig worden gesynthetiseerd door S ail, el homocysteïne, het cofactorproduct na methylgroepoverdracht, te laden met verschillende geactiveerde alcoholen. De synthetische cofactor analogen worden gezuiverd door middel van reverse phase HPLC, en in sommige gevallen is het zelfs mogelijk om de epi Mars bij zwavel te scheiden.

Smiling DNA is een sequentiespecifiek methyl transferase-geïnduceerde labelen van DNA. Hier wordt het concept gedemonstreerd door het labelen van PB 3 22 plasmide DNA met zes BAZ Aine cofactor, en de adine specifieke DNA methyl transferase. M-B-S-E-C een begint met het hawen van de zes BAZ bij 20 graden Celsius.

Eenmaal gedacht, repareer het reactiemengsel op ijs. Het omvat een microgram plasmide, 60 micromolar van zes BAZ, en 10 equivalenten van M-B-S-E-C een. HER herkenningssequentie op het DNA in modificatiebuffer.

Zorg ervoor dat u de zes BAZ en M-B-S-E-C een als laatste toevoegt. Zorg ervoor dat er geen AME is gebonden aan de meth transferase die u gebruikt, omdat de natuurlijke cofactor de labelen zal blokkeren. React Voor controles.

Vervang de MTA's door water om eventuele niet-specifieke cofactor modificaties te visualiseren en voeg water toe in plaats van cofactor om te testen op natuurlijke cofactor in het enzymconcentraat. Meng nu de reacties voorzichtig met een pipet en incubeer ze gedurende een uur op 55 graden Celsius. Tegen het einde van de incubatie, repareer een endonuclease mengsel op ijs door 10 microliter van 10 x recombinante tach, een buffer toe te voegen aan 80 microliter water, en vervolgens 3,3 microliter van recombinante tak een restrictie-endonuclease toe te voegen.

Na de incubatie, draai de reacties met een snelle spin en verifieer vervolgens de DNA-modificatie voor elk. Voeg twee microliter van 10 x tak, een buffer toe, en 28 microliter van het endonuclease mengsel. Meng de reacties met voorzichtig pipetten.

Incubeer nu de reacties gedurende een half uur bij 65 graden Celsius. Wanneer de reacties voltooid zijn, draai de oplossing met een snelle spin en verzamel 25 microliter van de reacties in nieuwe buisjes. Aan deze aliquots, voeg 2,4 microliter van strep TTR toe in gebufferd bij een millimolar per monomer van strep adin.

Incubeer nu deze reactie gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, voeg vijf microliter van zes x laadbuffer toe aan de voltooide reacties en draai 10 microliter uit op een 1%agros gel bij 80 volt gedurende ongeveer een uur. Beeld vervolgens de banden mt A af, de afkorting voor methyl transferase-gestuurde overdracht van geactiveerde groepen.

In deze demonstratie worden de methyl transferase set zeven, negen en dubbel geactiveerde cofactor C acht. Oin gebruikt om lysine vier van zijn histone H drie te labelen. Na het ontdooien van de componenten op ijs, repareer 20 microliter reactiemengsels, de testoplossing bevat modificatiebuffer 10 micromolar van histone H drie en voeg als laatste 10 micromolar van methyl transferases toe plus 600 micromolar van cofactor.

Maak een enzymcontrole door deioniseringswater te vervangen voor de C acht ON. Maak ook een cofactorcontrole om niet-specifieke modificaties te visualiseren door 60 millimolars van ADO met op te nemen om te concurreren met de synthetische cofactoren. Meng nu de reacties met langzaam pipe pesting en controleer hun pH met teststrips. Dubbel geactiveerde cofactor analogen worden opgeslagen onder C-condities.

Daarom kan de pH van uw reactieoplossing veranderen door co-factor toe te voegen, indien nodig in kleine hoeveelheden van 50 millimolar natriumhydroxide om de pH aan te passen. Incubeer nu de reacties gedurende twee uur bij 37 graden Celsius tijdens de incubatie. Reparatie. Een 12%SDS polyacrylamide gel net voordat de incubatie eindigt, maak 20 microliter van vijf x click mix bevattend drie milli molar kopersulfaat, drie milli molar T-H-P-T-A ligand 250 millimolar, natrium ACO aas, en zes millimolar Tamara azide.

Aan het einde van de incubatie, voeg vijf microliter van de click mix toe aan elke reactie en meng de reacties langzaam door per petting. Bescherm de reacties tegen licht met behulp van folie en incubeer ze gedurende een uur bij 20 graden Celsius. Na een uur, verwijder het overtollige chloroform door de eiwitten te precipiteren.

Voeg 75 microliter methanol, 18,7 microliter chloroform en