-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Het algemene doel van deze procedure is om de variaties in eiwitafbraaksnelheden op een systematische manier te bepalen door ze te koppelen aan de kinetica van gistgroei in vloeibare cultuur. Dit wordt bereikt door eerst cellen te kweken die een reportereiwit uitdrukken, bestaande uit een afbraaksignaal gekoppeld aan een metabolisch marker, overnacht tot stationaire fase in een geschikt selectief medium. Vervolgens wordt de optische dichtheid van de cellen gemeten om de groeikinetiek van de cellen te bepalen, en vervolgens wordt de minimale verdubbelingstijd van de cellen tijdens de logfase berekend uit de groeikinetiek met behulp van een speciaal softwareprogramma.

Uiteindelijk kan de berekende minimale verdubbelingstijd worden gebruikt om variaties in de eiwitafbraakkinetiek te definiëren. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals cyclamate of pulse chase afbraakassays is dat onze techniek eenvoudig is om op te zetten. De gegevensverwerving en -analyse zijn eenvoudig, en het ontwerp van het essay is uiterst modulair.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het eiwitafbraakveld, zoals welke elementen nodig zijn voor misvouwde eiwitherkenning door het ubiquitine-eiwitsysteem. Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik een screening wilde doen om de eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij ubiquitineverwijdering uit hun subset. Dus ontwikkelde ik een eenvoudige manier om meerdere monsters te vergelijken Om de cellen voor te bereiden op de analyse.

Begin door de geschikte ox atrofe gistcellen, zoals TRY 4 67, te transformeren met een plasmide dat een U drie Deron-fusie en een extra metabolisch marker bevat voor plasmideselectie en -onderhoud. Voor plasmideselectie en -onderhoud worden de cellen gekweekt op agarplaten onder een geschikt synthetisch gedefinieerd medium, zonder selectiemarkers voor aminozuren, overlevende kolonies worden in patches overgebracht, cellen uit patches worden overgebracht in vloeibaar medium en overnacht geïncubeerd bij 30 graden Celsius tot een stationaire fase is bereikt. Vervolgens worden voor 15 monsters of minder, 50 microliter van de cellen uit de overnachtcultuur verdund met 150 microliter van synthetisch gedefinieerd medium per put.

In een 96-wellplaat met doorzichtige bodem, gebruikt u een microplaatlezer om de OD 600-waarden van de monsters te bepalen. Bereken vervolgens het exacte volume dat nodig is om gistcellen te verkrijgen in een hoeveelheid gelijk aan een OD 600 van 0,25, centrifugeer de cellen gedurende één minuut bij 12.000 keer G en kamertemperatuur, suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter van het geschikte selectieve medium om een OD 600 van 0,25 te verkrijgen en breng 200 microliter van het verdunde stam over in één put van een nieuwe 96-wellplaat wanneer er meer dan 15 monsters moeten worden getest. Breng 10 microliter van de overnacht gekweekte stationaire cellen over in één put van een nieuwe 96-wellplaat die 190 microliter van het geschikte selectieve medium bevat om de groeikinetiek van de getransformeerde gistcellen onder selectieve omstandigheden te meten.

Stel vervolgens een multi-modus microplaatlezer in op een incubatietemperatuur van 30 graden Celsius, OD 600-meetintervallen van 15 minuten en orbitale en lineaire schudcycli van één minuut om de zeven minuten. Vervolgens worden de cellen gedurende 12 tot 24 uur bij 30 graden Celsius in de Microplaatlezer geïncubeerd. Wanneer de cellen de stationaire fase hebben bereikt, worden de ruwe gegevens geëxporteerd naar een spreadsheetbestand om de gistgroeikinetiek te bepalen met behulp van MDT Calc.

Zorg ervoor dat het spreadsheetbestand met de groeigegevens is opgeslagen en gesloten. Open vervolgens het MDT Calc-applicatieprogramma onder bestandspad. Klik op het rechthoekje om het spreadsheetbestand te lokaliseren onder bladnaam.

Voer de naam van het spreadsheet in waar de ruwe gegevens zich bevinden onder startpositie. Voer de spreadsheetcoördinaat van tijd, nul van het eerste monster in onder tijdkolom. Voer de letter in die de locatie van de tijdpuntkolom in seconden definieert onder lege kolom, voer de letter in die de locatie van de lege kolom definieert.

Bijvoorbeeld de A een put van de 96-wellplaat.Volgende. Kies onder OD-waarde de minimale getransformeerde OD 600-waarde die vereist is voor het starten van de MDT-berekening. Gewoonlijk 0,15 tot 0,25 om ervoor te zorgen dat de MDT alleen wordt berekend voor de monsters die de gedefinieerde D 600-waarde of hoger bereiken.

Zodra de laatste waarde is ingevoerd, klikt u op de berekenen-knop en bevestigt u dat de voortgangsbalk aan de rechterkant geleidelijk groen wordt. Exporteer ten slotte de twee sets gegevens die automatisch op het scherm verschijnen na voltooiing van de MDT-berekening naar een nieuwe spreadsheet. Bevestig dat de gegevens de MDT-waarde voor elke put bevatten die de minimale OD-waardetest doorstaan en de starttijd van het interval waaruit de MDT is berekend in dit representatieve experiment.

De relatieve verschillen in de kinetica van eiwitafbraak tussen het wild type en verschillende mutante stammen werden aanvankelijk vergeleken wild type U BBC zes, delta UBC zeven delta, of DOA 10 delta cellen die D een VMAU drie uitdrukken, werden gekweekt op synthetisch gedefinieerd compleet medium. Vervolgens om de gills te meten, werden de cellen gewassen en geïncubeerd in synthetisch gedefinieerd media. Min uracil vergelijkbare groeicurven en berekende MDT werden waargenomen voor alle stammen die in synthetisch gedefinieerd compleet medium werden gekweekt, wat de mogelijkheid uitsloot dat de deletie van een van de onderzochte genen de celgroei beïnvloedt.

In tegenstelling daarmee resulteerde incubatie in synthetisch gedefinieerd media minus uracil in een slechte groei van wildtypecellen, terwijl slechts een kleine groeifout werd waargenomen in de mutante stammen. UBC zeven is absoluut vereist voor DEG een VMAU drie afbraak waardoor een nauwkeurige beoordeling mogelijk is van zelfs de gedeeltelijke effecten van verschillende E twee mutanten. Dienovereenkomstig worden snelle groeikinetiek waargenomen in cellen die UBC zeven uitdrukken met de actieve plaatsmutanten, C 89