Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection
21 september 2014
-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.
Het algemene doel van deze procedure is om specifieke celpopulaties te isoleren uit het zich ontwikkelende cerebellum. Dit wordt bereikt door eerst cerebella te oogsten van neonatale muizen die fluorescente eiwitten dragen. De tweede stap van de procedure is om levende weefselsecties te verkrijgen met behulp van een vibrato.
De derde stap is om de externe germinale laag van het cerebellum te microdisseceren onder een fluorescente dissectiemicroscoop. De laatste stappen zijn om het weefsel te dissociëren in een enkele celsuspensie en cellen te verzamelen door middel van fluorescentie geactiveerde celsortering. Uiteindelijk kunnen de resultaten aantonen dat specifieke celpopulaties uit het cerebellum kunnen worden geïsoleerd.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals laser capture, microdissectie, is dat cellen levend zijn en kunnen worden gekweekt. Voor verder experimenteren Steriliseer voor deze procedure de chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf. Maak verse of opgewarmde 3% lage smeltaros klaar voor gebruik in een 37 graden Celsius waterbad.
Maak de vereiste oplossingen voor de papayan-gebaseerde celdissociatie. Bereid verse NBB 27 kweekmedia voor. Filter vervolgens, steriliseer en bewaar in een incubator.
Bereid de fax buffer voor en bereid de poly de lycine dekglasjes voor. Bekleed eerst autoclaaf dekglasjes met 100 microgram poly de lycine per milliliter steriel water. Bewaar vervolgens de dekglasjes gedurende twee uur bij 37 graden Celsius of een nacht bij kamertemperatuur.
Was later de dekglasjes met gedestilleerd water gevolgd door NBB 27 media voordat u de dekglasjes gebruikt. Droog ze volledig. Dit zal minimaal een uur duren voordat u begint.
Bereid eerst het dissectiegebied voor. Veeg het schoon met 70% ethanol. Bedek het vervolgens met een absorberend kussen.
Verwijder ten tweede de gereedschappen uit de sterilisatiezak en plaats ze voor gebruik. Laad vervolgens een schaal met ijskoud steriel DPBS met 1% pen strip en zet het op ijs. Dissecteer de hersenen van een P vier pup die fluorescente markers toont.
Breng het vervolgens over naar de voorbereide schaal met DPBS. Gebruik pincetten om het cerebellum voorzichtig te scheiden van de rest van de hersenen. Deze cerebella tonen de markers math een, GFP en nest in CFP waarbij de EGL GFP toont en de moleculaire laag positief is voor CFP.
Vul vervolgens een twee centimeter kubieke inbeddingsvorm met de agro-oplossing. Zorg ervoor dat deze niet warmer is dan 37 graden Celsius. Pak een cerebellum op met een geperforeerd lepel en demp het droog met een zacht tikken van weefsel.
Gebruik vervolgens pincetten om het in de mal te plaatsen. Gebruik een naald om de cerebella in verticale oriëntaties te brengen. Zodra er ongeveer vier in de mal zijn geladen.
Plaats de mal op ijs zodat deze snel zal stollen. Gebruik een scheermesje. Trim de blok om de sectieertijd te verkorten. Lijm vervolgens de blok op het plaatje zodat de cerebella verticaal staan.
Laad de vulbak met ijskoud DPBS met 1% pentriem en zet ijs onder de bak zodat deze koud blijft. Snijd nu de blokken met een vibrator. Snijd en verzamel 600 micron secties.
Verwijder ze van de ijsbak met een geperforeerd lepel en breng ze over naar een A-D-P-B-S gevulde schaal op ijs. Onder een fluorescente dissectiemicroscoop. Onderzoek de plakjes zo snel mogelijk.
Separeer voorzichtig de EGL van de rest van de cerebellaire sectie. Gebruik fijne pincetten om te dissecteren tussen de CFP-positieve moleculaire laag en de GFP-positieve EGL. Wees zeer voorzichtig tijdens microdissectie om besmetting van aangrenzende regio's te voorkomen.
Breng het GFP-positieve EGL-weefsel over naar een nieuwe DPBS-gevulde schaal op ijs. Vermijd het opnemen van enig moleculair laagweefsel, aangezien dit de cultuur zal besmetten met nestling expresserende Bergman-glia. Verwijder vervolgens de agro's rond het geïsoleerde EGL-weefsel.
De EGL kan nu worden gedissocieerd met behulp van een paan-gebaseerd protocol voor een enkele celsuspensie. Wanneer dit is voltooid, wordt de celsuspensie in fax buffer opgeschort. Ga verder met het verzamelen van de CFP-cellen met behulp van fax.
Sorteer ze met behulp van een hoge snelheid cytometer en een CFP-filter en trek ze in ijskoud fax buffer. Ongeveer 100.000 NPS zou per P vier cerebellum moeten worden verkregen. Centrifugeer vervolgens de gepoolde cellen bij 300 Gs gedurende vijf minuten.
Maak onmiddellijk gebruik van de cellen om ze te kweken. Suspendeer ze in voorverwarmd NBB 27 media. Laad ze vervolgens op de poly D lysine gecoate dekglasjes.
Cell bella-sneden werden bereid van P vier math een GFP nest in CFP muizen. Cerebellaire EGL bevatte voornamelijk GFP-expresserende GMP's en kon gemakkelijk worden gescheiden van de moleculaire laag verrijkt met CFP-expresserende glia. Facts-analyse toonde aan dat meer dan 85% van de cellen in de EGL conventionele GNP's waren. NEP's werden geïsoleerd uit de diepe delen van de EGL door microdissectie, gevolgd door facts.
Deze cellen vertegenwoordigden ongeveer 5% van de cellen in de EGL na vier dagen cultiveren. De door facts geïsoleerde NPS gaf aanleiding tot beta-tubuline-expresserende neuronen. Dit is kenmerkend voor lijnbeperkte neuronale voorlopercellen.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om snel te werken en het weefsel zoveel mogelijk op ijs te houden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van nestine-expresserende progenitorcellen uit het ontwikkelende cerebellum van pasgeboren muizen. De techniek combineert microdissectie en fluorescentie-geactiveerde cel sortering om deze progenitorcellen te zuiveren voor verder onderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Nestine-expresserende progenitorcellen zijn een onlangs geïdentificeerde populatie in het cerebellum.
- Het begrijpen van deze progenitorcellen kan inzicht bieden in de neuronale ontwikkeling.
- Bestaande methoden voor celisolatie leiden vaak tot contaminatie.
- Deze studie heeft tot doel de zuiverheid van geïsoleerde celpopulaties te verbeteren.
Doel van de studie
- Om specifieke neuronale progenitorpopulaties uit het cerebellum te isoleren.
- Om verdere experimenten en analyse van deze cellen mogelijk te maken.
- Om een techniek te demonstreren die de celviabiliteit voor kweek behoudt.
Gebruikte methoden
- Oogsten van cerebella van neonatale muizen met fluorescentiemerkers.
- Microdissectie van de externe kiemlaag onder een fluorescentiemicroscoop.
- Dissociatie van weefsel tot een enkelcellige suspensie.
- Fluorescentie-geactiveerde cel sortering voor het verzamelen van specifieke celpopulaties.
Belangrijkste resultaten
- Specifieke celpopulaties werden succesvol geïsoleerd uit het cerebellum.
- Meer dan 85% van de geïsoleerde cellen werd bevestigd als conventionele GNPs.
- NEPs werden geïsoleerd en vormden ongeveer 5% van de EGL-cellen.
- Geïsoleerde progenitoren gaven aanleiding tot beta-tubuline-expresserende neuronen.
Conclusies
- De methode maakt de isolatie van levende neuronale progenitorcellen mogelijk.
- Deze techniek kan de studie naar de ontwikkeling van het cerebellum verbeteren.
- Het behouden van de weefselvitaliteit is cruciaal voor een succesvolle celkweek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het isoleren van specifieke celpopulaties uit heterogene weefsels blijft een kritieke uitdaging bij vroege target-validatie en assay-ontwikkeling. Deze microdissectie-FACS-workflow maakt het mogelijk om levende, contaminatievrije progenitorcellen terug te winnen, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie en voorspellende betrouwbaarheid bij studies naar neuronale lineages. De mogelijkheid om geïsoleerde cellen te kweken slaat een brug tussen discovery biology en translationele biomarker-exploratie in preklinische modellen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar Nestin-expresserende progenitorcellen mogelijk als een afzonderlijke therapeutische hypothese bij de ontwikkeling van het cerebellum.
- Operationele waarde: Levert een gezuiverde celpopulatie, vrij van contaminerende granule neuron-precursoren en Bergman-glia, voor functionele doelwitbeoordeling.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de validatie van lineage-beperkte progenitorcellen via beta-tubulin+ neuronale differentiatie-readouts.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een levende single-cell suspensie die geschikt is voor daaropvolgende fluorescentie-geactiveerde sortering en fenotypische screening.
- Operationele waarde: Standaardiseert de weefselpreparatie door vibratoom-coupes en microdissectie onder fluorescentiegeleiding voor reproduceerbare isolatie van de EGL.
- Klaar voor assay: Levert ongeveer 100.000 levensvatbare progenitoren per P4 cerebellum, wat schaalbare compound-testen in kweek mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Geïsoleerde Nestin-expresserende progenitorcellen behouden hun levensvatbaarheid gedurende ten minste vier dagen in cultuur, wat preklinische fenotypische analyse ondersteunt.
- Afstemming van biomarkers: Beta-tubuline-expressie dient als een meetbare readout voor neuronale differentiatie, wat in overeenstemming is met translationele biomarkerstrategieën.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: De isolatie van zuivere progenitorcellen vermindert mechanistische ambiguïteit bij het minimaliseren van risico's in neuronale differentiatiepaden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothese-gestuurde isolatie van zeldzame celpopulaties mogelijk te maken voorafgaand aan functionele screening en mechanistische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van de identiteit van progenitorcellen en hun ruimtelijke lokalisatie binnen de externe kiemlaag.
- Screening: Levert een gestandaardiseerde suspensie van levende cellen op die compatibel is met FACS-gebaseerde sortering en assays voor blootstelling aan verbindingen.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve meting mogelijk van de frequentie van progenitorcellen (~5% van de EGL) en differentiatieresultaten via beta-tubuline-expressie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt geïsoleerde progenitorcellen met preklinische validatie door middel van langdurige kweek en lineage-specifieke markerexpressie.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: De microdissectie-FACS-workflow is aanpasbaar aan andere fluorescentielabelde weefsels, wat toepassing op platformniveau binnen ontdekkingsprojecten ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door levende Nestin-expresserende progenitorcellen te isoleren, vrij van contaminatie door aangrenzende cellen.
- Operationele waarde: Standardiseert het behoud van weefselviabiliteit door behandeling in ijskoud medium en snelle verwerking, wat een consistente start van de kweek mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in go/no-go-beslissingen bij studies naar neuronale progenitorcellen door het leveren van gezuiverde, functionele celinputs.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van doelen voor cerebellaire ontwikkeling via betrouwbare, contaminatievrije cellulaire modellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in fluorescent weefseldissectie en microdissectie onder een stereomicroscoop om de ruimtelijke precisie te waarborgen.
- Afhankelijk van cryostaat-compatibele inbeddingsmedia (laagsmeltende agarose) en vibratoom-sectiering met een dikte van 600 micron.
- Vereist een gestandaardiseerde FACS-opstelling met CFP- en GFP-filters voor parallelle isolatie van populaties uit de moleculaire laag en de EGL.
- Vereist een poly-D-lysine coating en de bereiding van NBB 27-medium voor de cultuur van adherente progenitorcellen en differentie-assays.
- Praktische beperking: Weefsel moet snel op ijs worden verwerkt om verlies van levensvatbaarheid te voorkomen, wat de batchgrootte beperkt zonder een gecoördineerde workflow.
