Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System

Het algemene doel van deze procedure is om de virale concentratie te bepalen door de kwantificatie van infectieuze varionen via het tellen van discrete plaques in een celcultuur. Dit wordt bereikt door eerst cellen uit te platen om een confluente monolaag voor infectie te vormen. De tweede stap is het uitvoeren van een seriële verdunning van het onbekende virale monster dat gekwantificeerd moet worden. Vervolgens worden de confluente monolagen geïnfecteerd met de seriële verdunning van de virale voorraad, gevolgd door het aanbrengen van een immobiliserende overlay. De laatste stap is het fixeren en kleuren van de plaques na de juiste incubatietijd voor het betreffende virus, om zo de discrete plaques te kunnen tellen. Uiteindelijk kunnen plaque-assays op verschillende manieren worden gebruikt en aangepast om de virale titers van een onbekend viraal monster te bepalen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de semi-solide overlay, is dat het aanbrengen en verwijderen veel eenvoudiger is bij zowel high-throughput als traditionele toepassingen. Daarnaast is er geen verhitting van de reagentia vereist. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het onderzoek naar vele verschillende lytische virussen, aangezien het gebruik van een vloeibare overlay in een 96-well formaat snelle screening van nieuwe therapeutische verbindingen mogelijk maakt, wat de vele uren in het laboratorium voor het uitvoeren van traditionele plaque-assays aanzienlijk kan verminderen.

Plate de dag vóór de assay de juiste cellen voor het betreffende virus om op de dag van infectie een confluentie van 90 tot 100% te bereiken. De stockoplossingen kunnen ook de dag vóór de assay worden voorbereid. Bereid eerst een fixeersolution van 10% formaldehyde in gedestilleerd water door 5,56 milliliter van een 36% formaldehyde-stockoplossing te mengen met 14,44 milliliter gedestilleerd water. Bereid vervolgens de kristalvioletkleuring bestaande uit 1% kristalviolet in 20% ethanol, verdund met gedestilleerd water. Bereid daarna, onder steriele omstandigheden, het juiste 2x plaque-medium voor het gebruikte celtype. Filtreer de oplossing door een 0,2 micron filter als een van de reagentia niet steriel is. Om een vloeibare overlay voor gebruik in de plaque-assay voor te bereiden, voegt u 2,4 gram Avicel toe aan een kolf met 97,6 milliliter gedestilleerd water onder snel roeren met een roerstaaf. Meng de oplossing bij kamertemperatuur totdat deze te viskeus wordt voor de roerstaaf. Verplaats de kolf op dit moment naar een schudkolf en schud deze gedurende 30 minuten krachtig om een gelijkmatige homogenisatie te garanderen. Autoclaveer de oplossing tot slot bij 121 °C bij 14 PSI gedurende 30 minuten.

Sla het mengsel na voltooiing van het programma verzegeld op bij kamertemperatuur op. Bereid voor een agarose-overlay een 0,6% agarose-stockoplossing in gedestilleerd water, meng dit met een roerstaaf en autoclaveer om de oplossing volledig op te lossen. Bereid voor een carboxymethylcellulose-overlay een 2% carboxymethylcellulose-oplossing in gedestilleerd water en meng deze. Autoclaveer vervolgens zoals eerder beschreven.

Gebruik de dag na het uitplaten een omgekeerde microscoop om de confluentie en levensvatbaarheid van de cellen te controleren voordat de assay wordt gestart. Controleer of de cellen een standaard cellulaire morfologie vertonen en een confluentie van ongeveer 90% hebben.

Voer een tienvoudige seriële verdunning van de infectieuze monsters uit in celgroeimedium, waarbij het aantal benodigde verdunningen varieert op basis van de verwachte titer van het betreffende virus. Bereid daarnaast een niet-geïnfecteerde controlemonster voor om onafhankelijk de cellevensvatbaarheid te waarborgen en te helpen bij de plaque-identificatie. Pipetteer de niet-geïnfecteerde controle en de seriële verdunningen in de putjes van de plaat, waarbij u er zorg voor draagt dat de monolaag niet wordt verstoord.

Gebruik een voldoende volume inoculum om de cellen te bedekken, terwijl het volume zo laag mogelijk wordt gehouden om het virale contact met de monolaag te maximaliseren. Plaats de platen in de weefselkweekincubator en infecteer de cellen gedurende 45 minuten tot één uur. Schud de platen elke 20 minuten voorzichtig heen en weer om een gelijkmatige bedekking te garanderen en te voorkomen dat de cellulaire monolaag uitdroogt.

Bereid tijdens de infectie de werkoplossing voor vloeibare overlays voor. Meng verwarmd plaque-medium en 1,2 tot 2,4% Stock Avicel op kamertemperatuur in een verhouding van één-op-één om een werkoplossing van 0,6 tot 1,2% Avicel overlay-medium te verkrijgen. Voor agarose- of CMC-overlays mengt u verwarmd plaque-medium en een voorraadoplossing van ofwel verhit 0,6% agarose of 2% CMC in een verhouding van één-op-één. Plaats dit vervolgens gedurende 30 minuten in een waterbad van 56 °C voor temperatuurequilibratie. Zorg ervoor dat de oplossing warm is, maar niet heet aanvoelt, om celdood en verminderde virale titers te voorkomen. Breng na de infectie de overlays aan op de geïnfecteerde monolagen. Incubeer de platen na toevoeging van de overlay gedurende twee tot 14 dagen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide, afhankelijk van het geanalyseerde virus.

Om cellen met een vloeibare overlay te fixeren, giet u de Avicel-overlay af of aspireert u deze, waarna u een 10% formaldehyde-oplossing in de wells pipetteert en fixeert bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot overnacht. Voor agarose of CMC voegt u de formaldehyde-oplossing direct toe aan de overlay gedurende één uur tot overnacht bij kamertemperatuur. Verwijder na fixatie de formaldehyde en verwijder vervolgens handmatig de semi-solide agarose-pluggen met de spatel.

Spoel de Avicel-celplaatjes met water om resterend fixatief van de overlay te verwijderen vóór het kleuren.

Dek de cellen voor de kleuring af met een minimale hoeveelheid kristalvioletoplossing gedurende ongeveer 15 minuten. Schud de platen indien nodig om een gelijkmatige dekking te garanderen. Was de kristalvioletkleuring voorzichtig af met water. Bewaar de plaques na fixatie, kleuring en droging onbeperkt voor toekomstige analyse. Tel de plaques in elke put en negeer putten met minder dan vijf of meer dan 100 plaques. Neem het gemiddelde van eventuele technische replica's van dezelfde verdunning. Noteer de grootte en morfologie van de plaques. Bepaal de virale titer van het voorraadmonster door het gemiddelde aantal plaques voor een verdunning en de inverse van de totale verdunningsfactor te nemen.

Deze afbeelding toont vergelijkingen van plaque-overlays voor het Rift Valley-koortsvirus met gebruik van 12-wells platen. Vero-cellen werden uitgeplaat in 12-wells platen tegen een dichtheid van 2,5 × 10⁵ cellen en geïnfecteerd met 200 µL van hetzelfde serieel verdunde startmonster van MP 12. Na infectie werden overlays van 1,5 mL bestaande uit 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC aangebracht om de overlays direct te vergelijken. Dit histogram toont de resultaten van de plaque-tellingen en titratie voor alle drie de overlays. Hier worden vergelijkingen van VEEV plaque-overlays met gebruik van 12-wells platen getoond. Vero-cellen werden zoals voorheen uitgeplaat en geïnfecteerd met een volume van 200 µL van hetzelfde serieel verdunde startmonster van de VEEV-TC 83 vaccinstam; na infectie werden overlays van 1,5 mL van 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC aangebracht zoals voorheen.

Opnieuw toont het histogram de resultaten van de plaque-tellingen en titrering voor alle drie de overlays. Deze afbeelding toont een voorbeeld van plaque-overlays met een hoge doorvoersnelheid. Een 96-wells plaat met Vero-cellen, uitgeplaat met 3 × 10⁴ cellen per well, werd gedurende één uur in quadruplo geïnfecteerd met 50 µL inoculum, gebruikmakend van hetzelfde serieel verdunde startmonster van Rift Valley fever virus MP 12. Voor de overlays werden finale concentraties van 0,6% en 1,2% Avicel getest om de haalbaarheid en reproduceerbaarheid van het gebruik van vloeibare overlays in een high-throughput methode te bepalen. Dit histogram toont de titers die zijn bepaald voor elke overlay.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elk virus verschilt en dat optimalisaties, waaronder het gebruik van verschillende celtypen, incubatietijden en/of groeimedia, noodzakelijk kunnen zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van een basis plaque-assay met behulp van zowel vloeibare als semi-solide overlays.