Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van granulocyten te beoordelen als een twee-parameters aanpak. Dit wordt bereikt door eerst granulocyten uit patiëntenbloedmonsters te incuberen met biodeeltjes en reagens om de oxidatieve burst te visualiseren. In de tweede stap wordt de fagocytose na incubatie geblokkeerd, en vervolgens worden de celoppervlaktereceptoren van belang gelabeld om de positieve identificatie van de granulocyten mogelijk te maken.

Uiteindelijk kunnen de geactiveerde granulocytensubpopulaties worden geïdentificeerd en geïsoleerd door beeldgebaseerde flowcytometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van nutritionele of klinische immunologie, zoals hoe voedingsgewoonten en voedingspraktijken bijdragen aan veranderingen en de functie van granulocyten. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Eric Prado, een doctoraalstudent uit mijn laboratorium.

Na het verkrijgen van het perifere bloedmonster, ontdooi de SIU's biodeeltjes en DHE op kamertemperatuur en ethyl malamed in een 37 graden Celsius B-bad, wanneer de reagentia zijn ontdooid, voeg 20 microliter van de ssus biodeeltjes toe aan vier afzonderlijke 1,2 milliliter buisjes in een steriele kap. Voeg vervolgens 40 microliter van het ontdooid DHE toe aan elk buisje dat de biodeeltjes bevat, en tik voorzichtig op de buisjes op de werktafel om het reagens in de bodems van de buisjes te verzamelen. Na het toevoegen van 100 microliter gemengd volbloed aan elk buisje, verwijder eventuele besmettende bloed langs de binnenrand van de buisjes met een wattenstaafje en meng het bloed en de reagentia met een elektronische pipette voor drie cycli.

Na de derde cyclus, plaats alle buisjes in een ijsemmer beschermd tegen licht. Bewaar vervolgens de buisjes gedurende 10, 20 of 40 minuten in een 37 graden Celsius snelbad, beginnend met de 40 minuten buis om ervoor te zorgen dat alle incubaties tegelijkertijd eindigen. Aan het einde van de incubatie, doseer 15 microliter ethyl malamed in elk van de buisjes.

Na 30 minuten, incubeer de cellen met elk 10 microliter van de juiste antilichamen. Na een uur verder incubeer de cellen in 750 microliter witte bloedcelfixeerde rode bloedcel lice-oplossing. Na nog een uur, centrifugeer de cellen en aspireer het supernatant vacuüm, waardoor een restvolume van 100 microliter boven het celpelletje achterblijft.

Voeg nu 10 microliter vers verdunde zeven A a d 50 microliter PBS en 25 microliter kalibratiekralen toe aan elk monster. Sluit vervolgens de buisjes, wikkel ze in folie en bewaar ze bij vier graden Celsius. Wanneer de beeldgebaseerde flowcytometer klaar is, voer elk monsterbuisje uit door minimaal 3000 ULU-sitegebeurtenissen te verzamelen met behulp van voorgedefinieerde parameters om de monsters te analyseren.

Gebruik de geautomatiseerde softwarecompensatiewizard van de IDEA-software om een compensatiematrix toe te passen op de ruwe beeldbestanden en om gecompenseerde beeldbestanden te maken. Laad vervolgens de individuele CIF-bestanden in de IDEA-software en genereer de volgende grafieken om de granulocytensubpopulaties voor elk patiëntenmonster te identificeren. Gebruik de onge stimuleerde controle als referentiestandaard om eerst de histogrammen van de lichtveldgradiëntwortelgemiddelde vierkant te gebruiken om de initiële poorten vast te stellen en om de cellen te identificeren die als scherp werden beschouwd.

Vervolgens om de enkele cellen te scheiden van het puin en de dubbelen, maak een stipplot van de lichtveld aspectverhouding versus de lichtveldoppervlakte. Zodra een schone populatie cellen is geïdentificeerd, stel een stipplot van CD 45 versus CD 66 B in. Om de CD 45 positieve CD 66 B positieve granulocyten positief te identificeren. Maak tenslotte een stipplot van de heldere detailintensiteit voor de aureus versus de heldere detailintensiteit voor de oxidatieve burst.

Om de subsetten van de geactiveerde granulocyten te identificeren die de lichtveldbeelden verzamelen in kanalen één en negen, de biodeeltjes in kanaal drie, de DHE in kanaal vier, de zeven a a d in kanaal vijf, de CD 66 B in kanaal 11 en de CD 45 in kanaal 12, kan ook een tweekleuren overlay worden gegenereerd die gecombineerde DHE- en biodeeltje gebeurtenissen weergeeft. Met beeldgebaseerde flowcytometrie kan een homogene populatie geactiveerde granulocyten worden gescheiden in drie verschillende activeringssubsetten. Met deze methode is de meest effectieve manier om de drie subsetten op te lossen door de heldere detailintensiteit voor de fagocytose tegenover de oxidatieve burst uit te zetten.

Verder gebruik van de coloclisatieswizard in de IDEAS-software maakt de kwantificering van de aanwezigheid van de gelijktijdige fagocytose en oxidatieve burst van de granulocyten mogelijk, een kenmerk van hoge activering. Bovendien toonde in dit experiment de 40 minuten incubatieperiode het grootste percentage zeer actieve granulocyten. Het opnemen van minimaal drie incubatieperioden in het protocol vergemakkelijkt dus de bepaling van hoe een bepaalde klinische behandeling de temporele activeringsstatus van de granulocyten kan veranderen.

Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals kralen-gebaseerde multiplex-assays worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld, hoe verandert de GRANULOCYTE-chemokineproductie in de supinate na blootstelling aan biodeeltjes?