Minimaal-invasieve techniek voor injectie in Rat Optic Nerve

Het algemene doel van deze procedure is om een minimaal invasieve methode te bieden voor het injecteren van geneesmiddelen of stamcellen in de oogzenuw van een levende rat. Dit wordt bereikt door de rat eerst te anesthetiseren, deze op de dissectiestand te positioneren en een hechtdraad in het conjunctiva in te brengen voor de manipulatie van het oog. In de daaropvolgende stap wordt de orbitale rand achter het oog gedissecteerd om de oogzenuw bloot te leggen.

Vervolgens wordt de glazen pipet in de oogzenuw ingebracht en worden het geneesmiddel of de stamcellen geïnjecteerd voordat de chirurgische wond wordt gesloten en de rat uit de anesthesie wordt gewekt. Uiteindelijk, na een bepaalde periode, wordt de rat geëuthanaseerd, wordt de oogzenuw gedissekeerd en kunnen de effecten van de chirurgische injectie of transplantatie via microscopie worden gevisualiseerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat deze benadering minimaal invasief is, waardoor de rat kan overleven zolang dat nodig is.

Bestudeer de effecten van chirurgische injectie of transplantatie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kate Schwartz, een student-technicus uit mijn laboratorium. Voer alle chirurgische procedures uit onder anesthesie met 2 tot 3% isofluorine.

Bevestig dat het passende anesthesieniveau is bereikt door middel van een teenknijptest en de ademhalingsfrequentie. Controleer of de rat niet reageert op het knijpen in de teen. Fixeer het dier indien nodig om hoofdbewegingen tijdens de procedure te voorkomen.

Plaats vervolgens een druppel lidocaïne op het operatieve oog. Gebruik elke 10 minuten kunsttranen om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen. Dien preoperatief een injectie buprenorfine toe van 0,01 milligram per kilogram subcutaan, en daarna elke zes tot acht uur indien nodig.

Houd het dier warm met een warmtematje. Bevochtig de vacht op de hoofdhuid met alcohol. Zorg ervoor dat het middel niet in contact komt met de ogen.

Zorg ervoor dat steriele instrumenten en een steriele techniek worden gebruikt om het risico op postoperatieve infecties te minimaliseren. Plaats vervolgens een 4-0 hechtdraad in de laterale conjunctiva en knoop deze vast met voldoende draad om zachte tractie mogelijk te maken. Maak een incisie van ongeveer één inch in de huid over de orbitale rand.

Gebruik een scalpel met een mesje van maat 10. Trek de huid en de onderliggende fascia terug en disseceer de fascia voorzichtig weg. Plaats één hechting in de teruggetrokken huid om de superieure orbitale zak bloot te leggen en overmatig bloeden in het operatiegebied te voorkomen.

Voorkom het doorsnijden van bloedvaten tijdens het dissecteren van de fascia. Door zachte tractie uit te oefenen op het conjunctiva, waarbij het oog naar beneden en uit de oogkas wordt getrokken, komt de musculus orbitalis superior in zicht. Om de nervus opticus bloot te leggen, moet het retroorbitale vet worden verwijderd en deze spier worden doorgesneden.

Het vet kan worden weggegooid en hoeft na de injectie niet te worden vervangen. Vanaf dit punt moet de fascia van de nervus opticus zichtbaar zijn als een bundel van de nervus opticus zelf, samen met bloedvaten die in de dura zijn ingekapseld. Om de diepere dissectie uit te voeren, wordt met het scalpel of een schuingeslepen naald van 31 gauge (om het doorprikken minder traumatisch te maken) een kleine incisie in de DRA gemaakt; gebruik hiervoor een getrokken glazen micropipet met een diameter van 50 tot 100 microns om stabiliteit te bieden.

Bevestig de micropipet op een micromanipulator en sluit deze aan op een plastic spuit van 20 cc. Trek beads of gereconstitueerde stamcellen in 0,5 tot 1 µL retrograde in de micropipet, samen met 0,5 µL methylblauwoplossing vóór en nadat de glazen pipet met kleurstof is gevuld. Breng met een spuit van 1 cc en een naald van 30 gauge de punt van de micropipet naar beneden op de nervus opticus, net boven de ingesneden dura.

Een kleine maar snelle beweging van de glazen tip in de oogzenuw veroorzaakt de minste schade, terwijl er een langzame en constante druk op de zuiger wordt uitgeoefend. De Evans blue-kleurstof moet het gebied van de geïnjecteerde oogzenuw accentueren. De kleurstof moet gelokaliseerd blijven in de oogzenuw zonder uit te lekken in de subarachnoïdale ruimte.

Volg de tweede band van de Evan's Blue-kleurstof om vast te stellen wanneer de injectie van de stamcellen is voltooid. Wanneer het benodigde volume in de oogzenuw is geïnjecteerd, laat u de zuiger los. Houd de micropipet vijf minuten lang in de oogzenuw om uitstoting door hoge druk bij het terugtrekken van de micropipet na voltooiing van de injectie te voorkomen.

Verwijder de micropipet samen met alle wattenstaafjes die zijn gebruikt voor de hemostase. Hecht de huid met 3.0 zijde en verwijder de conjunctivale hechting. Houd de ratten warm op een warmtemat tot ze uit de anesthesie ontwaken.

Laat een dier niet onbeheerd achter totdat het voldoende bewustzijn heeft teruggewonnen om in sternale recumbentie te blijven. Indien het dier tekenen van pijn vertoont, waaronder overmatige lethargie, ataxie of een moeizame ademhaling, dient er een passende analgesie te worden toegediend met intramusculaire buprenorfine, tot drie keer per dag. Na het experiment werden de ratten opgeofferd en geperfuseerd met paraldehyde.

De oogzenuwen werden zorgvuldig gedissecteerd en gemonteerd voor cryostaatsneden; hier is een voorbeeld te zien van een oogzenuw van een rat bij een lagere vergroting waarin Evans blue-kleurstof is geïnjecteerd. Om de plek te visualiseren, geeft de pijl de exacte locatie van de injectie aan. Deze dissectie werd enkele dagen na de injectie uitgevoerd, wat blijkt uit de beperkte diffusie van de kleurstof langs de zenuw na de ontwikkeling.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van regeneratieve neurologie om nieuwe manieren te verkennen om de oogzenuw te regenereren en mogelijk het verloren gezichtsvermogen te herstellen in dit ratmodel van demyeliniserende ziekte.