Het aanpassen van de Mens Videofluoroscopisch Swallow Studie Methoden voor het opsporen en karakteriseren Dysphagia in Muizen Disease Models
1 maart 2015
Deze studie succesvol menselijk Videofluoroscopisch slikken studie (VFSS) methoden voor gebruik met murine ziektemodellen behoeve van translationeel dysfagie onderzoek vergemakkelijken aangepast.
Het algemene doel van deze procedure is om de slikfunctie te bestuderen bij vrij bewegende knaagdieren, ook wel een videofluoroscopisch doorslikonderzoek of VFSS genoemd. Eerst wordt een voedingskamer gebouwd om knaagdieren tijdens het testen in een kleine ruimte te beperken. De tweede stap is het uitvoeren van gedragsconditionering met een testoplossing om maximale deelname te garanderen.
De volgende stap is het uitvoeren van VFSS-testen met de vooraf getrainde muizen. Ten slotte worden video's frame per frame geanalyseerd om doorslikparameters te kwantificeren. Uiteindelijk kan deze nieuwe beoordelingstool worden gebruikt om dysfagie te detecteren en te karakteriseren in modellen die ziektes nabootsen en functionele biomarkers te leveren voor gebruik in preklinische onderzoeken.
We kwamen eerst op het idee om observatiekamers te gebruiken omdat VFSS-testen van mensen vrijwillig en onbeperkt zijn, en we de menselijke klinische procedure nauw wilden nabootsen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van vergelijkbare bestaande methoden is dat het snel vrijwillige voedingsgedrag bij knaagdieren oproept om snel alle fasen van doorslikken te testen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen met video-analyse omdat de kleine en snelle bewegingen van het doorslikken en muizen moeilijk te onderscheiden zijn.
Begin met het samenstellen van de observatiekamers en assembleer vervolgens een spuitleveringssysteem om oplossing af te geven aan de peg-kommen tijdens het testen. Eenmaal geassembleerd, plaats de observatiekamer op een gemotoriseerde schaarlift voor bediening op afstand. Het belangrijkste voordeel van de op afstand bestuurbare schaarlifttafel is de verbeterde stralingsveiligheid voor onderzoekers, terwijl vrij bewegende knaagdieren in het fluoroscopie-beeldveld worden gehouden.
Bereid de muizen voor door ze aan de observatiekamer te wennen en ze te onderwerpen aan een overnacht waterregulatieperiode. Wanneer u klaar bent voor het testen, verwijdert u de kamer uit de kooi en maakt u deze grondig schoon. Gebruik een droogwisser om elke schoongemaakte buis te labelen voordat u deze terug in de kooigeplaats.
Bereid vervolgens de iohexol-oplossing met chocoladesmaak voor om de fluoroscopie-omgeving in te stellen. Gebruik een reserveobservatiekamer en peg-kom om de optimale hoogte en positie binnen de fluoroscoopbundel te bepalen die visualisatie van drinken in het laterale vlak mogelijk maakt. Stel de fluoroscopie-framesnelheid in op 30 frames per seconde.
Hogere framesnelheden kunnen worden gebruikt indien beschikbaar. Zorg ervoor dat een radiopaque kalibratiemarkering op de juiste plaats op de fluoroscoopcamera wordt geplaatst, zodat deze tijdens het hele testen op het displaymonitor zichtbaar is. Deze stap is noodzakelijk om kalibratie van lengtemetingen mogelijk te maken om stress door hantering te verminderen.
Observeer de kooi totdat een muis vrijwillig de observatiekamer binnenkomt. Eenmaal binnen, tilt u de kamer uit de kooi en bevestigt u voorzichtig de tweede eindkappe. Met herhaalde testen kunnen muizen gemakkelijk worden overgehaald om de kamer binnen te gaan wanneer deze voor hen in de kooi wordt geplaatst of wanneer ze door de staart boven de kameropening worden opgehangen.
Plaats de observatiekamer in de fluoroscopiemachine om VFSS-testen in het laterale vlak te beginnen. Gebruik vervolgens een spuitleveringssysteem om de peg-kom te vullen met iohexol-oplossing met chocoladesmaak. Start de videofluoroscopie-opname.
Wanneer de muis tijdens het testen begint te drinken, gebruikt u de op afstand bestuurbare lifttafel om de positie van de observatiekamer aan te passen, zodat het doorslikmechanisme in het beeldveld zichtbaar is. Pauzeer het opnemen elke keer dat de muis zich van de peg-kom afkeert om de duur van blootstelling aan straling te minimaliseren. Hervat het opnemen wanneer de muis terugkeert naar de peg-kom, vul de peg-kom indien nodig bij.
Het doel is om meerdere lange perioden van continu drinken op te nemen, wat typisch is voor de meeste muizen. Binnen de eerste twee minuten van het testen, stopt u met testen als de muis binnen vijf minuten niet drinkt, brengt u niet-compatibele muizen terug naar de kooigeplaats voor hertesten op een later tijdstip op dezelfde dag. Overschrijd een waterregulatie van 24 uur niet.
Wanneer u meerdere muizen uit dezelfde kooigeplaats test. Maak de peg-kom en de buis schoon met een droog papieren handdoek tussen de muizen. Knip het uiteinde van de PE-buis indien nodig bij.
Indien het tijdens het testen wordt gekauwd, maakt u de observatiekamer schoon indien nodig om eventueel gespetterd iohexol van de kamerwanden te verwijderen. Spoel de kamer af met kraanwater en droog met een papieren handdoek. Gebruik een videobewerkingssoftwareprogramma dat frame per frame analyse van de videofluoroscopie-opnamen mogelijk maakt.
Om de doorslikparameters van belang te kwantificeren, moeten ten minste twee getrainde recensenten elke video op een blinde manier analyseren. De primaire recensent bekijkt elke video om drie tot vijf lange drinkbeurten te identificeren en te analyseren. Dit criterium is gebaseerd op gepubliceerde niet-radiografische doorslikstudies die aantonen dat deze parameter voldoende is voor statistische analyse.
De secundaire recensent analyseert vervolgens onafhankelijk de drie tot vijf maatregelen per doorslikparameter voor elke muis die aanvankelijk werden geïdentificeerd en geanalyseerd door de primaire recensent. Discrepanties van de recensent worden vervolgens voor elke muis geïdentificeerd en opnieuw geanalyseerd totdat 100% consensus is bereikt. De onbetwiste waarden voor elke doorslikparameter worden vervolgens gemiddeld om de gemiddelde waarde voor elke muis te verkrijgen.
Wanneer er minder dan drie metingen worden verkregen voor een doorslikparameter, voert u een ontbrekende waarde in in de statistische database voor die maatregel. Deze voorbeelden zijn verkregen met behulp van een lage energie fluoroscopiesysteempositie. Een maakt visualisatie van het hele hoofd en de proximale thoracale regio mogelijk.
Het doorsliktriggerpunt is gecentreerd in het beeldveld. Positie twee maakt visualisatie mogelijk vanaf het doorsliktriggerpunt tot
Overzicht
Deze studie heeft methoden van de videofluoroscopische slikstudie (VFSS) bij mensen succesvol aangepast voor gebruik in murine ziektemodellen, wat translationeel onderzoek naar dysfagie faciliteert. De procedure is erop gericht om de slikfunctie bij vrij bewegende knaagdieren te beoordelen, waarbij menselijke klinische praktijken nauwkeurig worden nagebootst.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Translationeel Onderzoek
Achtergrond
- VFSS is een standaardmethode voor het beoordelen van het slikken bij mensen.
- Deze studie beoogt VFSS-technieken te repliceren in knaagdiermodellen.
- De methode maakt het mogelijk om vrijwillig voedingsgedrag te observeren.
- Het biedt een platform voor het detecteren van dysfagie in ziektemodellen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het bestuderen van het slikken bij knaagdieren.
- Het creëren van functionele biomarkers voor preklinische studies.
- Het verbeteren van het begrip van de mechanismen van dysfagie in ziektemodellen.
Gebruikte methoden
- Constructie van een voerkamer voor het vastzetten van knaagdieren tijdens het testen.
- Behaviorale conditionering met een testoplossing om deelname te waarborgen.
- Frame-voor-frame analyse van VFSS-video's om slikparameters te kwantificeren.
- Gebruik van een op afstand bestuurbare schaarlift voor verbeterde stralingsveiligheid.
Belangrijkste Resultaten
- De methode wekte succesvol vrijwillig eetgedrag op bij knaagdieren.
- Kwantitatieve analyse van slikparameters werd gerealiseerd via videoanalyse.
- Consensus tussen beoordelaars waarborgde een nauwkeurige meting van de slikparameters.
- De techniek toonde potentieel aan voor het identificeren van dysfagie in muismodellen.
Conclusies
- Deze nieuwe VFSS-aanpassing is effectief voor het bestuderen van dysfagie bij knaagdieren.
- De methode biedt een waardig instrument voor preklinisch onderzoek naar dysfagie.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit kader om dysfagie in verschillende ziektecontexten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het aanpassen van methoden voor videofluoroscopisch slikonderzoek (VFSS) bij mensen voor muismodellen maakt vroege detectie van dysfagie-fenotypes in preklinische ziektestadia mogelijk, wat bijdraagt aan target-validatie en mechanistische risicoreductie bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor neurodegeneratieve en neuromusculaire aandoeningen. Deze benadering biedt functionele biomarkers die gedragsassays verbinden met klinische eindpunten, waardoor het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen en beslissingen over de preklinische voortgang wordt verbeterd. Door de slikfysiologie bij vrij bewegende knaagdieren te kwantificeren, versterkt deze methode de translationele continuïteit van de ontdekkingsfase tot en met de preklinische fasen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de slikfysiologie te kwantificeren als een functionele read-out van de integriteit van de hersenstam en neuromusculaire circuits.
- Operationele waarde: Maakt gedragsconditionering en vrijwillige voeding in beperkte ruimtes mogelijk, waardoor stress-geïnduceerde variabiliteit bij murine fenotypering wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie van targets die betrokken zijn bij de controle over het slikken, zoals SOD1 in ALS-modellen, door genetische manipulatie te koppelen aan meetbare dysfagiefenotypes.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door de kwantificering van slikparameters te standaardiseren via frame-voor-frame videoanalyse.
- Operationele waarde: Pakt de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan via geblindeerde consensus door twee reviewers en gedefinieerde criteria voor drinkbuien.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de screeningreadiness en schaalbaarheid door het mogelijk maken van snelle tests van meerdere muizen per sessie met op afstand bestuurbare kamerpositionering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers door genotype-specifieke verschillen in slikfrequentie en het interval tussen slikbewegingen te detecteren in SOD1-muizen vergeleken met controlegroepen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door kwantificeerbare VFSS-parameters te bieden die correleren met de progressie van de ziekte.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op de waarde van predictieve risicoreductie door 13 consistent kwantificeerbare slikparameters te identificeren met behulp van fluoroscopie met lage energie, waardoor de detectiegevoeligheid bijna wordt verdubbeld in vergelijking met systemen met hoge energie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch werk, ter ondersteuning van hypothese-testen, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie van targets die de bulbaire functie beïnvloeden.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking of biologische risicoreductie ondersteunt door slikmechanica te kwantificeren als een proxy voor de functie van neurale circuits in ziektemodellen.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay, reproduceerbaarheid of kwantitatieve outputs wanneer dit door het artikel wordt ondersteund via gestandaardiseerde protocollen, geblindeerde analyse en consensusgestuurde parametermetingen.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische outputs die teams helpen om condities te vergelijken, waaronder slikfrequentie, het interval tussen slikken en de bolustransitietijd afgeleid van frame-per-frame VFSS-videoanalyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode aan preklinische continuïteit of biomarker-afstemming uitsluitend wanneer de bron dit ondersteunt door genotype-afhankelijke verschillen in slikfysiologie aan te tonen die klinische eindpunten van dysfagie spiegelen.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek door middel van gestandaardiseerd kamerontwerp, protocollen voor contrastmiddelen met smaak en een op afstand bediende beeldvormingsopstelling.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Predictieve betrouwbaarheid, validatie van targets en vermindering van mechanistische ambiguïteit bij fenotypes die door de hersenstam worden gemedieerd.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van slikfenotypering over muiscohorten en laboratoria heen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door dysfagie vroegtijdig te identificeren in preklinische pijplijnen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van functionele biomarkergegevens van VFSS in ziektemodellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in neurobehaviorale testen, het bedienen van videofluoroscopie en frame-voor-frame videoanalyse.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten fluoroscopiesystemen (bij voorkeur laag-energetisch voor hoge-resolutie imaging van muizen), op afstand bestuurbare positioneringstafels en videobewerkingssoftware voor geblindeerde beoordeling.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams omvatten het harmoniseren van het ontwerp van de kamer, de bereiding van het contrastmiddel (bijv. chocolesmaak iohexol) en de selectiecriteria voor drinkbeurten over verschillende locaties.
- Overwegingen voor adaptatie over modelsystemen omvatten het aanpassen van de kamergrootte, de palatabiliteit van het contrastmiddel en de positioneringsprotocollen voor verschillende knaagdierstammen en ziektesevereities.
- Praktische beperkingen onderbouwd door bronmateriaal omvatten de afhankelijkheid van het energieniveau van de fluoroscoop voor de detecteerbaarheid van parameters, waarbij hoog-energetische systemen de kwantificering beperken tot zeven parameters tegenover dertien bij laag-energetische systemen.
