Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van deze procedure is om de chemische toxiciteit van de kiemlijn grondig te beoordelen met behulp van de nematode C No Haitis elgan. Dit wordt bereikt door eerst wormen te synchroniseren door een verdunde bleekvloeistof toe te voegen aan een gemengde wormpopulatie van de C Elgan PXOL one GFP-stam. Deze stap genereert een groot aantal embryo's die worden beschermd tegen de bleekvloeistof door hun eierschaal.

De tweede stap is om een gesynchroniseerde L een larvenpopulatie te genereren door de embryo's te laten uitkomen in vloeistof zonder voedsel. Vervolgens groeien de wormen naar hun vierde larvale stadium of L vier, waarop ze 65 uur worden blootgesteld aan de chemicaliën van belang in vloeibare vorm. De laatste stap is de visualisatie door middel van fluorescentiemicroscopie van de expressie van de GFP-reporters in embryo's in de baarmoeder van de wormen.

Uiteindelijk weerspiegelt de verhouding van GFP-positieve embryo's in vergelijking met de DMSO-controle de antigeniteit van de geteste verbindingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals Rodin-modellen of celcultuuronderzoeken, is dat we de geniciteit en toxiciteit van de kiemlijn van chemicaliën in een compleet diermodel kunnen beoordelen terwijl we tegelijkertijd een hoogdoorvoeronderzoek uitvoeren. Vandaag zal dit worden gedaan door de postdoctoraalonderzoeker Dr. Daniella Perotti.

De grafische wormen voor deze procedure werden eerder bereid zoals beschreven in de bijbehorende protocoltekst, verzamel de GR wormen van het nematode groeimedium of NGM-platen door ze te wassen met een tot twee milliliter M negen en overbrengen naar een 15 milliliter kegelvormige buis. Laat de GR worm zich gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten naar de bodem van de 15 milliliter kegelvormige buis sedimenteren. Verwijder vervolgens het supernatant zonder de wormpellet te verstoren.

Breng de wormpellet over naar twee tot vier microcentrifugebuizen en voeg aan elke buis een milliliter verdunde bleekvloeistof toe. Incubeer gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Controleer de voortgang van de reactie onder de stereomicroscoop om te bevestigen dat alle wormen dood zijn.

Bleek niet langer dan vijf minuten omdat de embryo's kunnen afsterven. Verzamel de wormen door centrifugatie gedurende één minuut. Bij 3000 RPM.

Verwijder het supernat en voeg een milliliter steriele M negen toe om de reactie te neutraliseren. Zorg ervoor dat alle materialen die na de bleekbehandeling in contact komen met de wormen steriel zijn. Was de wormen twee keer met M negen-medium.

Verwijder het supernatant en voeg M negen toe tot 100 tot 200 microliter. Gebruik een glazen pastapipet om een druppel van het wormen M negen-mengsel toe te voegen aan heldere NGM-platen en incubeer ze gedurende minimaal 24 uur bij 20 graden Celsius om de embryo's te laten uitkomen zonder voedsel. De groei van de larven wordt gestopt in het L een stadium. Twee synchronisatie stappen.

Bleaching en L woord-uithongering worden gebruikt omdat het cruciaal is om een hoogsynchroon warme populatie te bereiken om het aantal L vier larven dat wordt gebruikt voor de blootstelling te maximaliseren. Een dag na de totstandkoming van een gesynchroniseerde L een larvenpopulatie, verzamel de L een larven van de heldere NGM-platen. Was de platen met een tot twee milliliter M negen en breng de L een larven over naar een 15 milliliter kegelvormige buis.

Laat de dode volwassen wormen gedurende ongeveer vijf minuten naar de bodem van de 15 milliliter kegelvormige buis sedimenteren. Verzamel het supernatant waar de L een wormen zich bevinden in een nieuwe 15 milliliter kegelvormige buis. Bezinken de wormen door centrifugatie gedurende twee minuten bij 2.600 RPM.

Verwijder het supernatant waarbij ongeveer 500 microliter overblijft. Bepaal de concentratie van wormen in de M negen-oplossing door het aantal wormen in 10 microliter druppels te tellen. Gebruik een stereomicroscoop om minimaal vijf druppels te tellen.

Pas de concentratie van de wormen aan tot 20 tot 25 wormen per microliter in M negen, en voeg vervolgens 50 microliter van het wormen M negen-mengsel toe aan NGM-platen. Gezeten met OP 50, voedingsbacteriën, incubeer gedurende 65 uur bij 15 graden Celsius om de gesynchroniseerde L een populatie te laten groeien tot ze de L vier-fase bereiken. Deze scherm maakt gebruik van een CL tegen een stam die een fluorescente transcriptionele reporter bevat om verstoring van de kiemlijn en inductie van embryonale aneuploïdie te detecteren.

Verzamel de L vier larven van de heldere NGM-platen door de platen te wassen met een tot twee milliliter M negen en ze over te brengen naar een 15 milliliter kegelvormige buis. Laat de L vier worm zich gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten naar de bodem van de 15 milliliter kegelvormige buis sedimenteren. Verwijder vervolgens het supernatant zonder de wormpellet te verstoren.

Voeg drie tot vijf milliliter M negen toe en bepaal de concentratie van wormen in de M negen-oplossing door het aantal wormen in 10 microliter druppels te tellen. Gebruik een stereomicroscoop om minimaal vijf druppels voor elk monster te tellen. Breng de wormen opnieuw op schorten in een concentratie van één worm per milliliter in M negen.

Verdun de eerder bereide OP 50-bacteriën tienvoudig met M negen. Zorg ervoor dat de opgeschorte bacteriën kamertemperatuur bereiken omdat lagere temperaturen de wormontwikkeling beïnvloeden. Gebruik eerst een multikanaals pipet om 100 microliter van het wormen M negen-mengsel toe te voegen aan elke put van een twee milliliter diepe ronde bodem 96-putjesplaat. Voeg vervolgens 400 microliter van de verdunde OP 50-bacteriën toe aan elke put aan het einde.

Elke put zal 100 wormen in 500 microliter bevatten. Voeg 0,5 microliter van de testchemische stof toe aan de gewenste putten om een ​​eindconcentratie van 100 micromolar te be