Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen
21 februari 2015
Dit protocol beschrijft hoe neurale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, om een robuuste en replicerende neurale celpopulatie op te leveren, die kan worden gebruikt om de ontwikkelingspaden te identificeren die bijdragen aan ziekte-ontstaan bij vele neurologische aandoeningen.
Het algemene doel van deze procedure is om neuro progeniтор cellen of NPCs te genereren uit humane geïnduceerde pluripotente stamcellen of hoge PSC's als platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen te bestuderen die bijdragen aan neurologische ziekten. Dit wordt bereikt door eerst hoge PSC's te differentiëren met behulp van dubbele smad-remmers tot neurale rosetten. De tweede stap is om deze neurale rosetten te oogsten en ze te laten groeien tot uitbreidbare NPC-populaties.
Vervolgens wordt lentivirale transductie met een spin-infectie gebruikt om de genexpressie te manipuleren. De laatste stap is om de NPC's in suspensie te laten groeien, zodat ze spontaan neurosferen vormen.
Uiteindelijk kan dit platform worden gebruikt om een verscheidenheid aan cellulaire fenomenen te meten. Bijvoorbeeld, het meten van het effect van genetische manipulatie op neuromigratie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in cellulaire mechanismen zoals migratie.
Het kan ook worden toegepast om andere biologische processen te bestuderen, zoals replicatie, oxidatieve stress, apoptose en neurietuitgroei. Differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen of hoge PSC's leidt tot de vorming van zichtbare neurale rosetten, die worden gekenmerkt als ronde clusters van neuro-epitheelcellen met aico basale polariteit voor de enzymatische selectie van neurale rosetten op dag 14. Aspereer media van de gehechte embryolichamen of eb's en voeg een milliliter neurale roset selectiereagens toe per put van een zes putten plaat geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende één uur.
Na een uur. Gebruik een P 1000 pipette man om voorzichtig het enzym uit elke put te verwijderen en voeg een milliliter D-M-E-M-F 12 toe per put. Om de rosetten te wassen, verzamel de één milliliter D-M-E-M-F 12 en verwijder deze snel terug in de put, waardoor de rosetten van de plaat worden losgemaakt.
Verzamel de rosetten in een falconbuis Pipetteer nog een milliliter D-M-E-M-F 12 en verwijder het snel in dezelfde put om de resterende rosetten los te maken. Probeer niet om de rosettenaggregaten te breken. Verzamel de neurale rosetten in dezelfde falconbuis.
Er kan meer enzym worden toegevoegd en deze procedure kan worden herhaald als de rosetten niet gemakkelijk loskomen wanneer alle neurale rosetten zijn verzameld. Draai de Falconbuis 300 G gedurende drie minuten. Aspereer de was en resus.
Suspendeer de rosetten in twee milliliter neurale progenitorcelmedia. Breng de cellen over naar een poly L ornithine gelamineerde zes wandplaat en laat ze groeien bij 37 graden Celsius gedurende één week. In dit laboratorium worden neurale progenitorcellen of NPCs gekweekt op matrigel platen, gevoed om de tweede dag en gehandhaafd op een zeer hoge dichtheid.
Om de NPC's te splitsen, aspereer eerst het media en voeg vervolgens een milliliter warme accutane toe per put van een zes putten plaat geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Breng de losgemaakte cellen voorzichtig over in een 15 milliliter buis met D-M-E-M-F 12 met zo min mogelijk mechanische stress. Tritreer de cellen niet terwijl ze in het enzympellet zitten, pellet de cellen door 1000 G gedurende vijf minuten te draaien na centrifugatie, aspereer het supernatant en resuspendeer de NPC's.
In ongeveer één milliliter NPC media per originele put van een zes putten plaat, worden vijf tot tien miljoen cellen verwacht per confluente put van een zes putten plaat na resuspensie en celtelling. Repl de NPC's plaat ongeveer een tot twee miljoen cellen per put van een zes putten plaat om de NPC's te handhaven. De efficiëntie van neurosferenvorming varieert tussen experimenten en cellijnen, maar komt meestal het best voor als tussen 200.000 en een miljoen cellen per put van een zes wand niet-adherente plaat worden geplaatst. Als er clumping optreedt, verlaag dan het aantal cellen dat wordt geplaatst. Ideaal binnen een tot twee dagen na splitsing.
De NP NPC's moeten worden getransduceerd met lentivirale of retrovirale vectoren om het percentage getransfecteerde cellen te verhogen. Gebruik spin-infectie. Aspereer het media uit elke put en vervang het door de relevante overexpressie of controle lentivirus of retrovirus getiteerd tot de gewenste infectiemultipliciteit verdund.
In NPC media Gebruik 1,5 milliliter per put van een zes putten plaat, draai bij 1000 G en kamertemperatuur gedurende één uur in een plaatcentrifuge. Plaats de plaat na de draai terug in de incubator om cellulaire dood te verminderen. Vervang het media binnen acht uur na spin-infectie.
Begin deze procedure door de NPC-afgeleide NEUROSPHEREN eenmaal in NPC-media te wassen om cellulaire deeltjes te verwijderen. Kantel de plaat onder een hoek van 45 graden en laat de neurosferen bezinken en verwijder vervolgens zoveel mogelijk media zonder de neurosferen te aspereren. Vervang met vers media.
Vervolgens pikt u handmatig de NPC-afgeleide NEUROSPHEREN onder een microscoop met behulp van een P 200 pipetteer een neurosferen naar elke put van een matrigel-gecoate 96-putten plaat. Het is belangrijk om neurosferen van vergelijkbare groottes te kiezen om variabiliteit in de resultaten te verminderen. Voeg een extra 0,5 milligram matrigel toe, verdund in koud NPC-media, aan de neurosferen in elke 96-putten plaat.
Gebruik een pipettetip om handmatig elk individueel neurosferen in het midden van de put te centreren. Laat migratie van neurosferen gedurende 48 uur plaatsvinden. Na fixatie en kleuring van de cellen met de gewenste immunohistologische markers, fotografeert u de neurosferen in hun geheel met behulp van een Forex microscoopobjectief. Om radiale migratie te meten, gebruikt u image J-software.
Gebruik het freehand-selectiegereedschap om handmatig de rand van de verst migreren cellen te traceren. Zorg ervoor dat het gebied is gecontroleerd in het venster met ingestelde metingen dat onder het analysetabblad wordt gevonden. Gebruik vervolgens de meetfunctie om het gebied van de resulterende vorm te berekenen.
Gebruik de waarde van de gebiedsmeting en de vergelijking voor het gebied van een cirkel om de buitenste
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de differentiatie van neurale progenitorcellen (NPC's) uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) om neurologische ziekten te bestuderen. Het proces omvat het genereren van NPC's die kunnen worden uitgebreid en gemanipuleerd voor onderzoeksdoeleinden.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelbiologie
- Neurologische aandoeningen
Achtergrond
- Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) kunnen differentiëren in verschillende celtypen.
- Neurale progenitorcellen (NPCs) zijn essentieel voor het bestuderen van hersenontwikkeling en ziekten.
- Inzicht in de differentiatieroutes van NPCs kan leiden tot nieuwe inzichten in neurologische aandoeningen.
- Dit protocol heeft als doel een betrouwbare bron van NPCs voor onderzoek te creëren.
Doel van de studie
- Om NPCs uit hiPSCs te genereren voor het bestuderen van neurologische aandoeningen.
- Om cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij de pathogenese van de ziekte.
- Om een platform te bieden voor toekomstig onderzoek naar neurodevelopmentale stoornissen.
Gebruikte methoden
- Differentiatie van hiPSCs naar neurale rozetten met behulp van duale SMAD-remmers.
- Oogsten van neurale rozetten om uitbreidbare NPC-populaties te kweken.
- Lentivirale transductie met spin-infectie om genexpressie te manipuleren.
- Kweken van NPC's in suspensie om neurosferen te vormen.
Belangrijkste resultaten
- NPC's succesvol gedifferentieerd uit hiPSC's.
- Uitbreidbare NPC-populaties opgezet voor onderzoek.
- De effectiviteit van lentivirale transductie aangetoond.
- NPC's vormden neurosferen in suspensiecultuur.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het genereren van NPC's uit hiPSC's.
- NPC's kunnen worden gebruikt om de mechanismen van neurologische ziekten te onderzoeken.
- De aanpak kan verder onderzoek naar therapeutische strategieën faciliteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode stelt biofarmaceutische R&D in staat om vroege neuro-ontwikkelingsgebeurtenissen in menselijke cellen te modelleren, wat een schaalbaar platform biedt om ziektemechanismen te onderzoeken voordat symptomen optreden. Door uitstreembare, genetisch hanteerbare NPC's te genereren uit patiëntafgeleide hiPSC's, kunnen teams target-hypothesen valideren door middel van empirische tests van de effecten van genmanipulatie op cellulaire fenotypes zoals migratie, replicatie, oxidatieve stress en apoptose. Dit ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij target-validatie en informeert go/no-go-beslissingen in preklinische neurowetenschappelijke programma's.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de moleculaire gevolgen van veranderingen in genexpressie in een neuraal systeem van menselijke oorsprong te beoordelen.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare NPC-bron voor consistente fenotypische screening over verschillende genetische perturbaties heen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door genetische manipulatie te koppelen aan kwantificeerbare cellulaire uitkomsten die relevant zijn voor neurologische ziektepaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert NPC-populaties die neurosferen vormen en geschikt zijn voor high-content assays voor migratie en stressrespons.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, schaalbare productie van neurosferen mogelijk voor reproduceerbare screeningscampagnes van verbindingen of genetische factoren.
- Klaar voor assay: Produceert expandeerbare NPC's die cryopreserveerd en gepassaged kunnen worden en kunnen worden overgebracht naar suspensiecultuur voor longitudinale fenotypische monitoring.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie door menselijke neuro-ontwikkelingsprocessen in vitro te modelleren.
- Ziekterelevant Systeem: Maakt gebruik van patiëntafgeleide NPCs om de effecten van de genetische achtergrond op cellulaire fenotypen vast te leggen, wat de klinische relevantie vergroot.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Maakt een vroege beoordeling mogelijk van de effecten van targetmodulatie op neuronale differentiatie en gliale bestemming, wat bijdraagt aan de veiligheids- en werkingsprofilering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het genereren van target-hypotheses tot de identificatie van leads, en biedt een menselijk cellulair systeem om targets te valideren voordat men overgaat tot medicinale chemiecampagnes.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en het verminderen van risico's bij targets door gecontroleerde manipulatie van genexpressie in NPC's en de meting van downstream fenotypische effecten mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare NPC's en neurosferen voor het kwantificeren van effecten op migratie, replicatie, oxidatieve stress en apoptose na genetische of farmacologische perturbatie.
- Analytics: Genereert op beeldvorming gebaseerde migratiemetrieken (bijv. radiale afstand via ImageJ) en fluorescentie-reporterread-outs om de transductie-efficiëntie en fenotypische veranderingen te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Behoudt de relevantie voor ontwikkeling en ziekte door patiëntafgeleide cellen te gebruiken om vroege pathogene gebeurtenissen bij neurologische aandoeningen te modelleren.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een schaalbaar NPC-platform dat kan worden hergebruikt voor meerdere targets, genetische achtergronden en fenotypische assays binnen een neuroscience discovery-portfolio.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door de afhankelijkheid van post-mortem of niet-humane modellen te verminderen via direct empirisch onderzoek in humane neurale progenitorcellen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde protocollen voor NPC-expansie, cryopreservatie en de vorming van neurosferen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets mogelijk te maken, waardoor falen in een laat stadium door onvoorziene biologische mechanismen in humane neuronen wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Faciliteert datagestuurde prioritering van targets op basis van fenotypisch herstel of verergering in een klinisch relevant humaan cellulair systeem.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, neurale differentiatie en lentivirale transductietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot met poly-L-ornithine/laminine of Matrigel gecoate oppervlakken, neurale progenitor-medium en centrifugatieapparatuur voor het oogsten van rozetten en het splitsen van NPC's.
- Noodzaak van gestandaardiseerde protocollen voor neurosfeervorming en migratie-assays om variabiliteit tussen experimenten en cellijnen te minimaliseren.
- Vereist biosafety level 2-plus condities bij het werken met lentivirale of retrovirale vectoren om een veilige hantering te garanderen.
- Succes is afhankelijk van zorgvuldige hantering om breuk van rozetten tijdens het oogsten te voorkomen en het handhaven van optimale zaaidichtheden voor neurosfeervorming.
