Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen
24 maart 2015
Het is een uitdaging om stabiele, intravitale, hoogwaardige beelden van immuuncellen in de lever te maken. Hier bieden we een zeer gevoelige en betrouwbare methode om migratie en cel-cel-interacties van immuuncellen in de muizenlever gedurende langere perioden (ongeveer 6 uur) te bestuderen door middel van intravitale multifoton laser scanning microscopie in combinatie met intensieve zorg monitoring.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie en interactie van leukocyten in progressieve leverontstekingsziekten te volgen. Om de reeks gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan hoe deze cellen worden aangetrokken in het leverweefsel en hun mogelijke betrokkenheid bij de immunopathologie beter te begrijpen. Dit wordt bereikt door eerst een tracheotomie uit te voeren om de controle over de ademhaling van de muis te krijgen, een cruciale stap om de langetermijnoverleving van het dier te garanderen.
Als tweede stap worden de muis laparotomies om het leverweefsel chirurgisch bloot te leggen, waardoor toegang tot het orgaan met de multifotonmicroscoop wordt verkregen. Vervolgens wordt de lever gefixeerd en gepositioneerd door deze in een aeros in te bedden om bewegingsartefacten te minimaliseren. Beeldvorming kan gedurende enkele uren worden uitgevoerd, wat leidt tot hoogwaardige, time-lapsesequenties die de veranderingen in rekrutering, positionering en interactie van individuele leukocyten volgen.
In het proces van het ontwikkelen van leverontsteking, kan deze methode helpen om belangrijke vragen op het gebied van acute en chronische leverontsteking te beantwoorden, zoals leukocytenrekrutering, cel-cel-interacties of mechanismen van immunopathologie. Het grote voordeel van deze techniek in vergelijking met conventionele microscopie is dat multifocale microscopie langdurige beeldvorming mogelijk maakt met vrijwel geen verstoring van het monster met lage verbleking of fototoxiciteit, evenals optische plakjes tot 100 micrometer diep in het weefsel, en dit komt door de unieke fysica van de laser van het ver rode laserlicht. Welnu, deze methode kan inzicht bieden in leverziekten.
Het kan gemakkelijk worden aangepast aan andere systemen. Omdat de methode van stabilisatie en fixatie, het weefsel kan worden toegepast op vrijwel alle vragen van intravitale microscopie, zodat het gemakkelijk organen zoals milt, nier of zelfs subcutane tumoren kan beeldvormen met behulp van vloeibare gerelateerde cellen. Het is ook mogelijk om alle leukocytensubsets te visualiseren en hun interacties en leverontsteking te bestuderen.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn bij deze methode worstelen vanwege de extreme complexiteit van kleine dierdierenchirurgie. Echter, vanwege onze eigen ervaring, is dit slechts een beperkende factor voor een paar weken en heeft het slechts wat praktische ervaring nodig. Vanwege de kwetsbaarheid van leverweefsel, zijn de voorbereidingsstappen moeilijk te leren, en visuele demonstratie van de methode is essentieel. Na het opzetten van de anesthesie, vult u de muis aro-fase met 3% aros, door deze in een hoek van 40 graden te gieten.
Zorg er vervolgens voor dat het chirurgische werkgebied volledig gedesinfecteerd is, evenals alle vereiste instrumenten en ga zo maar door. Vervolgens verdooft u de muis met een intraperitoneaal injectie van een anesthesiecocktail. Vijf minuten later controleert u de reflexen van het dier en desinfecteert u vervolgens de huid en brengt u oogzalf aan op de ogen.
Vastzet nu de muis op de voorbereidingstafel. Gebruik tape om deze te positioneren om de ventrale zijde voorzichtig bloot te leggen door de nek licht te strekken. Een rubberen band die aan de snijtanden is gehaakt, kan dit bereiken.
Voer nu de eerste incisie uit onder de kin van ongeveer 0,5 tot een centimeter lang. Vervolgens dissecteert u voorzichtig het bindweefsel tussen de speekselklieren en vindt u de spierbuis rond de luchtpijp. Scheur de spier voorzichtig open om de luchtpijp bloot te leggen.
Trek een draad onder de luchtpijp en open vervolgens de luchtpijp met microscharen met een T-vormige incisie in de incisie. Plaats de beademingsbuis ongeveer een halve centimeter. Breng de buis vooruit met kleine anatomische pincetten.
Beveilig vervolgens de buis met hechtingen. Vervolgens voor extra veiligheid, hecht u de buis aan de huid, sluit u de incisie in de huid af met cyanoacrylaat en bevestigt u de buis aan het hoofd van het dier. Gebruik kleefband om de anesthesie te onderhouden met een continue stroom van 2% iso fluorine.
Nadat u de muis hebt voorbereid op de operatie, maakt u een kleine huidincisie onder het borstbeen en verlengt u de snede lateraal onder de ribben aan beide zijden. Cauteriseerd alle blootgestelde bloedvaten in dit proces. Om bloedingen te minimaliseren, voert u een kleine initiële snede uit bij de lineaire elleboog om toegang te krijgen tot de buikholte.
Verleng de snede horizontaal, sluit alle bloedvaten af en geef toegang tot de lever. Verplaats nu de muis naar de agro-fase en stapel dia's aan beide zijden van het dier om het op zijn plaats te houden. Deze stapels moeten overeenkomen met de hoogte van de muis, zodat de fase voor de lever, die later zal worden geplaatst, geen overmatige druk op de buik uitoefent.
Gebruik nu hechtingen in het borstbeen om de ribben terug te trekken. Een vier nul hechting zal voldoende zijn. Nadat u de ribben hebt teruggetrokken, snijdt u de ligamenten die de lever en het diafragma verbinden, tot aan de aorta, maar werk met extra voorzichtigheid om het vat niet te scheuren of te snijden. Snijd ook het ligament dat de lever en het maagdarmkanaal verbindt.
Draai de muis 45 graden om de toegang tot de grotere leverkwab te verbeteren. Neem een standaard dekglas en kleef het langs de randen zodat het niet scherp is. Plaats het over de buikholte.
Dit zal dienen als een podium voor de lever om de lever op het podium te positioneren. Schuif voorzichtig een dubbele kogelstiftsonde of een gevulde spatel onder de lever en houd de bovenkant van het orgaan vast. Met behulp van een vochtig weefselmechanische druk zal de leverweefsel onmiddellijk worden beschadigd, dus het is essentieel om het orgaan voorzichtig te behandelen.
Til vervolgens de lob op de schuif en trek er voorzichtig aan en in positie. De lob zal meestal gebogen of gevouwen eindigen, probeer de randen voorzichtig uit te vouwen door het weefsel op te tillen met een dunne spatel of een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor stabiele intravitale resolutie-imaging van immuuncellen in de lever, waardoor de observatie van hun migratie en interacties over langere perioden mogelijk wordt. Door gebruik te maken van intravitale multiphoton laser scanning microscopie, maakt deze aanpak gedetailleerde monitoring van het gedrag van leukocyten in een muismodel van leverontstekingsziekten mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Intravitale beeldvorming
Achtergrond
- Het begrijpen van de dynamiek van immuuncellen bij leverontsteking is essentieel voor inzichten in de immunopathologie.
- Langetermijn beeldvormingstechnieken zijn noodzakelijk om het gedrag van leukocyten vast te leggen.
- Eerdere methoden misten de gevoeligheid en betrouwbaarheid voor langere observatieperioden.
- Deze studie pakt deze uitdagingen aan met een nieuwe benadering van beeldvorming.
Doel van de studie
- Om de migratie en interactie van leukocyten in de lever te onderzoeken.
- Om de rekruteringsmechanismen van immuuncellen tijdens leverontsteking te verduidelijken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor langetermijnbeeldvorming van immuunresponsen.
Gebruikte methoden
- Tracheotomie uitgevoerd voor de ademhalingscontrole van de muis.
- Laparotomie om de lever bloot te leggen voor beeldvorming.
- Inbedding van de lever in een medium om bewegingsartefacten te verminderen.
- Intravitale multiphoton laser scanning microscopie voor hoge-resolutie beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle langetermijnbeeldvorming van leukocytenmigratie en -interacties.
- Hoge-resolutie time-lapse-sequenties legden veranderingen in het gedrag van leukocyten vast.
- Inzichten in de dynamiek van immuuncelrekrutering bij leverontsteking.
- De haalbaarheid van de methode voor het bestuderen van immuunresponsen is aangetoond.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van de dynamiek van immuuncellen.
- Het vergroot ons begrip van de rol van leukocyten bij leverziekten.
- Deze benadering kan worden toegepast op andere modellen van ontsteking en immuunrespons.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Langdurige intravitale beeldvorming van immuunceldynamiek in de lever maakt mechanistische risicoreductie van targets voor inflammatoire leverziekten mogelijk door de rekrutering, positionering en interacties van leukocyten in real-time te visualiseren. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door het gedrag van CXCR6-expresserende immuuncellen te koppelen aan ziekteprogressie in preklinische modellen, waardoor het voorspellende vertrouwen in therapeutische hypothesen wordt vergroot. De methode biedt een ziekterellevant systeem voor het beoordelen van immunomodulerende verbindingen onder fysiologisch relevante omstandigheden.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de migratie en positionering van CXCR6.gfp+ immuuncellen in gezonde en zieke levers te volgen.
- Operationele waarde: Biedt functionele validatie van leukocyten-subsets die betrokken zijn bij immunopathologie door middel van directe observatie van cel-celinteracties.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het visualiseren van belemmerde migratie en celvastlegging in CCl4-geïnduceerde leverbeschadigingsmodellen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, zoals migratiesnelheid, totale verplaatsing en interactiefrequentie voor compoundscreening.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare time-lapsegegevens met een hoge resolutie en minimale fototoxiciteit over beeldvormingsvensters van 6 uur.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde preparatie- en fixatieprotocollen mogelijk die de variabiliteit tussen experimenten en laboratoria verminderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt de dynamiek van immuuncellen met de ziekteprogressie door het gedrag van CXCR6+-cellen te correleren met acute en chronische leverschade.
- Operationele waarde: Faciliteert de validatie van preklinische modellen door longitudinale beoordeling van leukocytenverkeer in intact weefsel mogelijk te maken.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door imaging-resultaten te koppelen aan histopathologische uitkomsten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling, door dynamische, kwantitatieve read-outs te bieden van het gedrag van immuuncellen in een ziekterelevante levermicro-omgeving.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing mogelijk van mechanismen voor leukocytenrekrutering en stromale interacties bij inflammatoire leverziekten.
- Screening: Levert assay-klare, gestandaardiseerde weefselpreparatie met stabilisatie van vitale functies voor consistente beeldvormingscondities.
- Analytica: Biedt track-gebaseerde metrieken, waaronder migratiesnelheid, verplaatsing en interactiekaarten voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt intravitale observaties met ziektefenotypen via correlatie met CCl4-geïnduceerde hepatocellulaire schade.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Aanpasbaar aan andere organen en ziektemodellen via gestandaardiseerde chirurgische preparatie en een raamwerk voor intravitale beeldvorming.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in leukocyten-gestuurde immunopathologie te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde anesthesie, monitoring van vitale functies en weefsinbeddingsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door visualisatie van target-engagement en cellulaire respons in intact weefsel.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van directe observatie van immuuncelmodulatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie, anesthesiebeheer en het bedienen van intravitale microscopie.
- Afhankelijk van multifoton laser-scanning microscopen met instelbare ver-rood excitatie en gevoelige detectoren.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor chirurgische voorbereiding, monitoring van vitale functies en pijplijnen voor beeldanalyse.
- Aanpassing aan andere modellen vereist validatie van weefselstabilisatie en reporterexpressie in de doelorganen.
- Praktische beperkingen omvatten de chirurgische complexiteit en de noodzaak van gespecialiseerde training om de levensvatbaarheid van het dier tijdens langdurige beeldvorming te behouden.
