Een 3D Human longweefsel Model voor functionele studies op Mycobacterium tuberculosis Infectie

Het algemene doel van deze procedure is om een in vitro longweefselmodel te construeren voor studies van M tuberculosis-infectie. Dit wordt bereikt door eerst een fibroblast-collageenmatrix op de filter van een inzetstuk van een celkweekplaat te plaatsen. In de tweede stap worden geïnfecteerde immuun- en longepitheelcellen op de fibroblast-collageenlaag geplaatst.

Het resulterende 3D-weefselmodel wordt vervolgens aan lucht blootgesteld om de afscheiding van slijm en de stratificatie van het epitheel te bevorderen. In de laatste stap wordt het weefsel geoogst en gemonteerd. Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de vorming van een vroeg granuloma door M tuberculosis te analyseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek of bestaande methoden, zoals in vitro monolaag van cellen, is dat de cellen in dit systeem aanwezig zijn in een 3D-micro-omgeving, waardoor de vorming van granulaten mogelijk is bij infectie met virulente microbacteriën die lijken op menselijke TB Om collageen-ingebedde fibroblasten te bereiden, begint u met het behandelen van longfibroblastcellen met tripsine gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius wanneer de cellen zijn losgekomen, stopt u de reactie met acht milliliter volledig dmem en draait u vervolgens de cellen neer. Breng de pellets opnieuw op in verse dmm bij 230.000 cellen per milliliter en plaats de cellen op ijs. Voeg vervolgens een inzetstuk per putje toe aan een zes.

Putjesplaat en verdeel een milliliter van een vers bereide cellulaire laagmix in elke inzet, zorg ervoor dat de mix de hele inzet bedekt zonder luchtbellen. Plaats de plaat vervolgens 30 minuten in een 37 graden Celsius incubator. Aan het einde van de incubatie meng twee milliliter collageen met 615 microliter premix in een steriele conische buis op ijs om de pH van het collageen per inzet te neutraliseren.

Voeg vervolgens 58 microliter volledig dmem en 327 microliter longfibroblasten per inzet toe aan het collageenmengsel. Pipetteer omhoog en omlaag om de cellen gelijkmatig door de mix te verdelen. Voeg nu snel drie milliliter van de cellulaire laag toe aan de zijkant van elke inzet op elke acellulaire collageenlaag.

Zorg ervoor dat u luchtbellen vermijdt en breng de plaat terug in de celkweekincubator gedurende nog eens twee uur. Na de polymerisatie van het collageen, voegt u twee milliliter volledig dmem toe aan de bodem van elke put en brengt u de plaat terug in de incubator voor nog eens 24 uur. De volgende dag gebruikt u een paar schone pincetten om de inzetjes een voor een voorzichtig op te tillen en het kweekmedium uit de bodem van elke put te aspireren.

Voeg vervolgens twee milliliter volledig DMM toe aan de bodem van elke put en twee milliliter volledig DMM aan elke inzet. Ververs beide volumes medium om de twee dagen gedurende vijf tot zeven dagen. Om de geïnfecteerde macrofagen te bereiden, begint u met het incuberen van een macrofagencultuur gedurende vier uur met virulente M tuberculosis bij een besmettelijkheidsmultipliciteit van 10.

Aan het einde van de incubatie, wast u de cellen drie keer met PBS om de extracellulaire bacteriën te verwijderen en behandeld u de macrofagen met twee millimolar, A DTA gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen loskomen, suspendeert u ze in antibioticavrij volledig dmm. Aas vervolgens al het medium van de fibroblast-collageenmatrixplaat en voeg 1,5 milliliter vers antibioticavrij volledig DMM toe aan de buitenste kamers.

Meng vervolgens fluorescerend gelabelde monocyten met de geïnfecteerde macrofagen in een verhouding van vijf op één in 50 microliter van het antibioticavrije volledige DM EM per inzet. Voeg vervolgens 50 microliter van het monocyte-macrofaagmengsel toe aan de binnenkant van elke inzet en breng de plaat terug in de incubator. Voeg na een uur langzaam twee milliliter kweekmedium toe aan de wanden van de inzetjes om te voorkomen dat de cellen losraken en incubeer de culturen nog eens 24 uur.

Om de culturen met longepitheelcellen te zaaien, voegt u 4 miljoen epitheelcellen per milliliter toe in 50 microliter volledig dmm bovenop de immuuncel-fibroblast-collageenmatrices. Incubeer de cellen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter antibioticavrij, volledig DMM toe aan de inzet zoals zojuist is aangetoond en kweek de cellen nog eens drie dagen.

Vijf dagen na het zaaien van de geïnfecteerde macrofagen aspireert u al het kweekmedium uit de plaat en voegt u 1,8 milliliter antibioticavrij, volledig DMM toe aan de buitenste kamers. Blootstel de 3D-weefselmoden vervolgens gedurende twee dagen aan lucht in de incubator zonder medium toe te voegen aan de inzet op dag zeven na het zaaien.

Verwijder het medium volledig uit de plaat en meng de weefselmodellen met 4%paraldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Gebruik vervolgens een scalpel om de membranen van de inzetputjes te scheiden. Gebruik vervolgens een schone scalpel om voorzichtig de zijden van de weefselmodellen te verwijderen en snijd elk weefsel in ongeveer vier gelijkgrote vierkante stukken.

Breng de stukken over op superfrostglasplaatjes en laat ze vijf minuten drogen. Gebruik vervolgens fluorescerend montagemedium met anti-fade en dpi om de weefsels te monteren en bedek ze met deksels. Laat de plaatjes op kamertemperatuur in het donker staan totdat ze droog zijn en verzegel vervolgens de randen van de deksels met nagellak.

Wanneer de lak is opgedroogd, dompelt u de plaatjes in 70%ethanol voor een overdracht uit de BSL drie faciliteit. Om de weefsels te visualiseren, verwerft u 3D-beelden van vijf tot tien verschillende velden die het hele weefselstuk bedekken met een resolutie van 512 bij 512 met Zack die minimaal 20 micron dikte bedekt met een scheiding van één tot 1,5 micron tussen de stapels op een fluorescente confocale microscoop voor 3D-kwantificering van de cel