Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Het algemene doel van deze procedure is om kinasen te identificeren die een substraat van belang fosforyliseren met behulp van methoden voor grootschalige screening. Dit wordt bereikt door eerst cellen te transfecteren met plasmiden die kinase FU tot glutathion als transferase of GST tot expressie brengen. De tweede stap is het uitvoeren van een GST-kinase pulldown.

Vervolgens worden de monsters in gels geladen, die vervolgens worden gelopen en gekleurd met kumasi briljant blauw kleurstof. De laatste stap is het drogen van de gels en het blootstellen aan autoradiografiefilm. Uiteindelijk is het door het ontwikkelen en interpreteren van de resulterende films mogelijk om kinase-substraatparen te identificeren, aangezien elke baan representatief is voor een afzonderlijke kinase-assay.

Bestaande methoden voor het identificeren van een kinase voor een bekend gefosforyleerd substraat omvatten het gebruik van bio-informaticabenaderingen om te zoeken naar een consensussite in het substraat, het detecteren van complexen tussen kinase en substraten met behulp van biochemische technieken en een trial-and-error-benadering, en het zoeken naar conte-consensussubstraten op basis van hun bekende biologische functie. Deze benaderingen zijn tijdrovend en leiden niet altijd tot succes. Onze aanpak maakt snelle identificatie van kinase-substraatparen mogelijk op basis van functionele resultaten.

Toen we voor het eerst het idee hadden voor deze methode, waren we bezorgd dat er in vitro onvoldoende specificiteit zou zijn. Het blijkt echter dat de substraatspecificiteit uitstekend is en we vinden vaak dat alleen kinasen van hetzelfde gezin in staat zijn om een bepaald substraat in de screening te fosforyliseren. Dit is vooral duidelijk wanneer we multiplexen met meerdere substraten in elke screening, wat aantoont dat de procedure Courtney, een technicus uit mijn laboratorium, zal zijn. Begin de procedure met de bereiding van reagentia, platen en cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Als platen met kinaseplasmiden zijn ingevroren, ontdooi ze dan op kamertemperatuur en centrifugeer gedurende drie minuten bij 1900 keer G om vocht aan de bodem van de putjes te verzamelen. Meng 8,6 milliliter gereduceerd serummedium met 312,7 microliter vetgedragen transfectiereagens en laat het mengsel vijf minuten in elke put staan. Van de 96-wel platen die de kinaseplasmiden bevatten, 10 microliter van het gereduceerd serummedium.

Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor klein volume en voeg vervolgens 10 microliter van de gereduceerd serummedium transfectiereagensmix toe per putje, gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor klein volume en laat de plaat 20 tot 45 minuten staan. Resuspenseer vervolgens 2 93 T-cellen bij 0,75 miljoen cellen per milliliter in 80 milliliter volledig delcos-gemodificeerd medium of DMEM bij 100 microliter van de celsuspensie per putje. Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor standaard volume, controleer de putjes onder een microscoop op uniforme celverdeling voordat u de plaat terugbrengt naar een incubator van 37 graden Celsius gedurende 24 uur.

Om het GST-kinase pulldown-experiment te beginnen. Maak een oplossing van vier millimolar per vanadate door 60 microliter 0,2 molair natriumvanadate te mengen met 540 microliter water in een tweede buis gemengd 2,7 microliter 30% peroxide en 1,4 milliliter fosfaatgebufferd zout of PBS. Voeg de twee oplossingen samen en laat het mengsel 15 minuten staan voor gebruik.

Gebruik een multikanaals pipette om twee microliter 0,25 molair calciumchloride in elke put te doseren, gevolgd door 2,5 microliter van de bewezen date-oplossing. Incubeer elke plaat gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en plaats vervolgens op ijs, houd de platen op ijs. Verwijder het medium uit elke put, gebruik onmiddellijk een vacuüm bij 50 microliter per putje van ijskoud lysisbuffer.

Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van de standaardcassette, laat de plaat 30 minuten op ijs staan om te licentie. Nadat de platen gedurende drie minuten bij 1900 keer G op vier graden Celsius zijn gecentrifugeerd, schraap de cellen van elke put met een multikanaals pipette en breng alle inhoud over naar geschikt gelabelde vbo. 96-wel platen, draai de platen gedurende 10 minuten bij 1900 keer G op vier graden Celsius tijdens het draaien, vul glutathion-gecoate platen met 100 microliter per putje van ijskoud lysisbuffer.

Als spoeling, houd de platen op ijs. Na centrifugatie van de bodemplaten, draai de glutathionplaten om boven een spoelbak om de lysisbuffer uit te schudden en dep op een papieren handdoek. Breng de lysisbuffer van de V-bodemplaten over naar de glutathionplaten door de plaat te kantelen en een multikanaals pipette te gebruiken, wees voorzichtig om de pellet op de bodem niet te verstoren.

Dek vervolgens de platen af en laat ze minimaal twee uur op ijs staan. Om dicht bij het einde van de tweede bindingsstap te binden, bereid een radioactiviteitswerkstation voor en zorg ervoor dat de nodige veiligheidsmaatregelen voor radioactief werk zijn genomen. Stel de hybridisatieoven in op 30 graden Celsius.

Draai de glutathionplaten om boven een spoelbak om de lysisbuffer uit te schudden en dep op een papieren handdoek. Spoel de putjes drie keer met 100 microliter lysisbuffer zonder PMSF. Laat de putjes niet droog zitten.

Houd ze in de spoeling totdat u klaar bent om verder te gaan. Bereid vervolgens 55 milliliter een X-kinasebuffer of een x kb voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 50 microliter een x kb toe aan elke put van de plaat met behulp van een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor standaard volume.

Bereid vervolgens oplossing A voor door een oplossing te maken die het substraat van belang en myelinebasiseiwit of MVP bevat, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol een voor een. Draai de platen om boven een spoelbak om de ene XKB-spoeling te verwijderen, dep op een papieren handdoek en voeg onmiddellijk 30 microliter oplossing A toe.Gebruik een geautomatiseerde vloeistofdispenser voorzien van een cassette voor klein volume. Houd de platen op ijs.

Bereid vervolgens oplossing B voor in het radioactiviteitswerkgeb