Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

In deze video laten we zien hoe we bio functioneel gemodificeerde planaire ondersteunde lipide bilayers bereiden en karakteriseren. We beschrijven ook in detail de architectuur van een totaal interne reflectiemicroscoop met mogelijkheden voor detectie op eenmoleculair niveau. We meten de excitatie vermogensdichtheid, de vloeibaarheid en de eiwitdichtheid van de lipide bilayer.

Laten we beginnen met een korte inleiding over planaire glasondersteunde lipide bilayers. Wanneer kleine uni lamellaire blaasjes een schone glasoppervlakte tegenkomen, barsten ze open en verspreiden zich om een aaneengesloten lipide bilayer te vormen. Op een waterkussen kiezen we doorgaans voor palmmateriaal.

Oleoylfosfocholine of POPC is het overheersende lipide omdat het bij kamertemperatuur en 37 graden Celsius vloeibare lipide bilayers vormt. Voor functionele modificatie voegen we nikkel antiox toe, een synthetisch lipide met een nikkelchelerende kopgroep, die poly histamine tag eiwitten bindt. Bijvoorbeeld de co-stimulatoire molecuul B zeven een, het adhesiemolecuul, ICAM een, en het fluorescent gelabelde peptide beladen MHC-molecuul voor T-cel herkenning zoals hier getoond, maar dit bilayer systeem kan in principe worden gebruikt om volledig verschillende processen in een verscheidenheid van biologische systemen aan te pakken.

Vanwege de aard van het planaire systeem kunnen fluorescentiegebeurtenissen worden gemonitord in totale interne reflectiemodus, die de cellulaire achtergrond aanzienlijk vermindert en zeer goed geschikt is voor fluorescentiemicroscopie op eenmoleculair niveau Voor lipide bereiding heb je de lipiden, POPC en nikkel antiox chloroform nodig, en een schone ronde bodemkolf. Los de lipiden op in de gewenste verhouding en chloroform en droog ze onder vacuüm zoals hier getoond. Na hoge vacuüm behandeling overnacht vormen de lipiden een film aan de binnenkant van de kolf. Voor lipide rehydratie, gebruik Degas PBS bij 10 milliliter van de Degas PBS tot de gedroogde lipidemengsel.

Niet mengen. Om lipide oxidatie te voorkomen, vul je de kolf met een inert gas zoals stikstof of argon, draai de kolf. De lipiden vormen een melkachtige suspensie.

Neem een ​​kleine steekproef als een blanco voor de spectrofotometer om gasuitwisseling tijdens de volgende stap te voorkomen. Het is erg belangrijk om de kolf met de lipidesuspensie goed te verzegelen. Gebruik een hittebestendige plakband, bijvoorbeeld autoclaaftape waarbij luchtbescherming tijdens fysische vorming met behulp van een gesloten ultrasone bad.

Na het monteren van de kolf, start je de sonicatieprocedure bij een maximaal vermogen van 170 watt. Soniceer gedurende 60 minuten. Vanwege de fysische vorming is de troebelheid aanzienlijk gedaald.

Dit kan worden geverifieerd door spectrofotometrie bij 550 nanometer. Gebruik de aliquot genomen vóór sonicatie als blanco. De optische dichtheid bij 230 nanometer, die indicatief is voor de lipide hoeveelheid, moet constant blijven.

Hier vullen we kleine ultra centrifugatiebuizen met één milliliter visueel suspensie en plaatsen ze in een vaste hoek rotor van een tafelcentrifuge. Het is erg belangrijk om alleen kleine uni laina blaasjes te gebruiken voor bilayer bereiding. Grotere en meer dichte multi laina blaasjes, die ook worden gevormd tijdens sonicatie, interfereren met bilayer vloeibaarheid en moeten daarom worden gepaleerd en verwijderd door centrifugatie.

Eerst centrifugeren we gedurende één uur bij 150.000 G bij kamertemperatuur. De resulterende snat wordt vervolgens gedurende aanvullende acht uur gecentrifugeerd bij 288.000 G bij vier graden Celsius. Glasvlakken moeten zeer schoon zijn voordat lipideblaasjes zich erop kunnen verspreiden om een ​​aangrenzende en vloeibare bilayer te vormen.

Hiervoor plaatsen we dekglasjes in een Teflon kussen, dat we vervolgens in een glazen vat oefening. Wees uiterst voorzichtig met oogbescherming, beschermende handschoenen en een laboratoriumjas en werk in een chemisch kabinet. We voegen één deel 30% waterstofperoxide toe en vervolgens drie delen geconcentreerd zwavelzuur om een ​​zeer reactieve en oxidatieve perio mono zwavelzuur te geven.

Dit mengsel reageert gewelddadig met organische stoffen, inclusief die van uw huid, ogen en kleding. Het verwarmt onmiddellijk. Incubeer de slides gedurende 30 minuten.

Pak het dekglas met een pincet. Was de zuur grondig af op beide kanten van het schone dekglas met W gedistilleerd of hoogwaardig niet-geïoniseerd water. Plaats vervolgens de slide op een Teflon stand en laat deze niet langer dan 10 minuten drogen om meerdere individuele lipide bilayers tegelijkertijd te kunnen produceren. We lijmen gedroogd dekglas met snel uithardend.

Tweekomponente epoxylijm op een acht wel of een zestien wel lab tech kamer. Verwijder eerst voorzichtig het originele lept glas plaatje uit zijn frame. Meng de twee lijmcomponenten in een verhouding van één op één.

Verspreid het gelijkmatig in de bodemgroeven van het kamerframe. Plaats het schone dekglas op de met lijm bedekte bodem van het kamerframe. Zorg ervoor dat de lijm gelijkmatig is verspreid tussen de glasplaat en het plastic frame.

Laat de lijm 30 minuten uitharden. Verdun de lipide fysieke suspensie in PBS één op tien en filter het door een 0,2 micron filter bij 120 microliters van deze verdunning in elk putje van een acht wel kamer of 60 microliters in elk putje van een zestien wel kamer. Zorg ervoor dat het hele glasoppervlak is bedekt en wacht 20 minuten.

De bilayer is nu gevormd Om residuele les kwijt te raken spoelt u elk putje met 30 milliliter PBS. Vermijd ten koste van alles luchtblootstelling van het glasoppervlak. Dit zou de bilayer onmiddellijk vernietigen om ervoor te zorgen dat elk putje hetzelfde volume buffer bevat Voor de volgende eiwitversieringsstap, vult u elk putje volledig en verwijdert u de vloeistof koepel.

Neem 330 microliters weg. Dit laat ongeveer 350 microliters binnen elk putje over om de bilayer met eiwitten te versieren, bereid een mastermix voor met poly histamine tag eiwitten naar keuze en voeg 50 microliters ervan toe aan elk putje.

Eiwitten binden zich aan de nikkel anti kopgroep van het don