Snel In Situ Hybridisatie met behulp van oligonucleotideprobes op Paraformaldehyde vooraf hersenen van ratten met Serotonine Syndroom
23 september 2015
Dit protocol beschrijft een snelle en vereenvoudigde in situ hybridisatiemethode die ideaal is voor paraformaldehyde-gefixeerde hersenen, waardoor de noodzaak voor langdurige complexe stappen wordt verminderd bij het gebruik van vers bevroren weefsels. De methode is gevalideerd met behulp van de identificatie van het serotonine 5-HT2A receptorgen htr2a bij ratten.
Het algemene doel van deze procedure is om een snelle in C twee hybridisatie uit te voeren op met paraformaldehyde gefixeerd hersenweefsel. Dit wordt bereikt door eerst hersenweefselsecties te dehydreren en de secties te behandelen met prebehandeling een, twee en drie reagentia. De tweede stap is om de secties te hybridiseren met primaire oligonucleotide probes en vervolgens tweede, derde en vierde probes.
Voeg vervolgens snelrood substraat toe om doel-RNA te detecteren. De laatste stap is om het niveau van mRNA-signalen te kwantificeren met Image J-software. Uiteindelijk kunnen veranderingen in RNA-genexpressie worden verkregen door de experimentele en controlegroepen te vergelijken.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat het relatief eenvoudig, goedkoop, reproduceerbaar is en minder dan twee dagen duurt om te voltooien. Dit werk werd ontwikkeld door mijzelf en John Jay Lenan van de Ross University School of Veterinary Medicine en Jean Soza en RU Tao van de College of Medicine, Florida Atlantic University. In deze procedure worden uit haar dehydratie vier dia's van microscoopslideboxen gehaald die in de min 80 graden Celsius vriezer worden bewaard.
Wijs de secties toe aan de tests van P-P-I-B-D-A-P-B en HT twee A gene mark en label ze met een balpen. Dompel vervolgens de slides in 100% alcohol bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Droog vervolgens de slides gedurende vijf minuten in de afzuigkap voor pre-behandeling pipet 20 microliters van de pre-behandeling een reagens op elke sectie, plaats de slides op een rackrail in een vochtbak.
Schud voorzichtig de vochtbak op een horizontale shaker bij lage snelheid gedurende 10 minuten. Was vervolgens de slides twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende twee minuten. Dompel de slides in een 1000 milliliter beker met 450 milliliter van de pre-behandeling twee reagens.
Kook vervolgens de slides gedurende vijf minuten totaal op 100 graden Celsius om de RNA-structuur te herstellen. Was daarna de slides twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende twee minuten per keer. Plaats de slides gedurende vijf minuten in 100% alcohol.
Droog vervolgens de slides gedurende vijf minuten. Gebruik in de afzuigkap een hydrofobe pen om een cirkel te tekenen rond het geselecteerde gebied in de weefselsectie. Pipet vervolgens 10 microliters van het pre-behandeling drie reagens naar elk geselecteerd gebied om de penetratie van de sonde te verhogen en dek de vochtbak af met een deksel.
Plaats vervolgens de bak in de hybridisatieoven uitgerust met een horizontale shaker. Stel de oventemperatuur in op 40 graden Celsius en schud de bak gedurende 30 minuten voorzichtig. Was daarna de slides twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende twee minuten per keer. Pipet in deze stap 10 microliters van de P-P-I-B-D-A-P-B of HTR twee A sonde op de geselecteerde gebieden.
Dek vervolgens de vochtbak af met een deksel om verdamping van het reagens te voorkomen. Schud voorzichtig de slides op de horizontale shaker bij lage snelheid terwijl u ze gedurende twee uur incubeert bij 40 graden Celsius in de oven. Was vervolgens de slides twee keer met wasbuffer gedurende twee minuten per keer, pipet 10 microliters van het amplificatie een reagens op elk geselecteerd gebied.
Schud en incubeer de slides gedurende 30 minuten bij 40 graden Celsius. Was vervolgens de slides twee keer met wasbuffer gedurende twee minuten per keer, pipet 10 microliters van het amplificatie twee reagens op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de slides gedurende 15 minuten bij 40 graden Celsius.
Was daarna de slides twee keer met wasbuffer gedurende twee minuten. Pipet elke keer 10 microliters van het amplificatie drie reagens op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de slides gedurende 30 minuten bij 40 graden Celsius.
Was vervolgens de slides twee keer met wasbuffer gedurende twee minuten. Pipet 10 microliters van het amplificatie vier reagens op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de slides gedurende 15 minuten bij 40 graden Celsius.
Was vervolgens de slides twee keer met wasbuffer gedurende twee minuten. Pipet 10 microliters van het amplificatie vijf reagens op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de slides gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
Was vervolgens de slides twee keer met wasbuffer gedurende twee minuten. Pipet 10 microliters van het amplificatie zes reagens op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de slides gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
Was vervolgens de slides nogmaals twee keer met wasbuffer gedurende twee minuten per keer. Pipet nu 10 microliters van het rode reagens op elk geselecteerd gebied, plaats de slides in de vochtbak op de horizontale shaker op kamertemperatuur en schud voorzichtig gedurende 10 minuten bij lage snelheid. Was vervolgens de slides twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende 10 minuten.
Droog elke keer de slides gedurende 15 minuten in de oven op 60 graden Celsius. Plaats daarna de slides gedurende vijf minuten in xyleen in de afzuigkap. Pipet vervolgens 20 microliters van xyleen-gebaseerde montagemedia op elk geselecteerd gebied en dek af met een dekglas.
Sleep en plaats in deze stap het afbeeldingsbestand in het hoofdvenster van Image J. Ga naar de menubalk en selecteer afbeelding. Selecteer vervolgens type uit het vervolgkeuzemenu en selecteer acht bit.
Selecteer vervolgens aanpassen en selecteer drempelwaarde om het dialoogvenster te openen. Pas de onderste balkwaarde in het dialoogvenster aan zodat de ongewenste achtergrond wordt verwijderd. Ga naar de menubalk en selecteer Analyseren, selecteer vervolgens analyseer deeltjes om een tweede dialoogvenster te openen.
Stel de deeltjesgrootte in op 10. Selecteer vervolgens randen weergeven en selecteer resultaten weergeven en samenvattingsvakken. Klik ten slotte op oké om de deeltjesgegevens in de dialoogvensters te bekijken.
Voer voor de spreadsheetberekening de gegevens in in het Excel-blad en bereken het gemiddelde aantal de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een snelle en vereenvoudigde in situ hybridisatiemethode die ideaal is voor met paraformaldehyde gefixeerd hersenweefsel. De methode vermindert de noodzaak voor langdurige, complexe stappen bij het gebruik van vers bevroren weefsels en is gevalideerd door de identificatie van het serotonine 5-HT 2A-receptor gen htr2a bij ratten.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genexpressie
- In situ hybridisatie
Achtergrond
- In situ hybridisatie is een techniek die wordt gebruikt om specifieke RNA-sequenties in weefselcoupes aan te tonen.
- Traditionele methoden kunnen tijdrovend en complex zijn, waarbij een uitgebreide verwerking van monsters vereist is.
- Deze studie heeft tot doel het proces te stroomlijnen voor een betere efficiëntie.
- De serotonine 5-HT 2A receptor is belangrijk voor het begrijpen van diverse neurologische functies.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een snel in situ hybridisatieprotocol voor hersenweefsel.
- Het vereenvoudigen van de procedure met behoud van de nauwkeurigheid bij het detecteren van genexpressie.
- Het valideren van de methode met het htr2a-gen als target.
Gebruikte methoden
- Dehydratie van hersenweefselcoupes.
- Behandeling met voorbehandelingsreagentia.
- Hybridisatie met primaire en secundaire oligonucleotidesondes.
- Detectie van doel-RNA met behulp van fast red substraat en kwantificering met Image J software.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol identificeert met succes het htr2a-gen in rattenbreinweefsel.
- Het demonstreert een significante vermindering van de verwerkingstijd in vergelijking met traditionele methoden.
- Kwantitatieve analyse toont betrouwbare mRNA-signaalniveaus aan.
- Vergelijkingen tussen de experimentele groep en de controlegroep onthullen veranderingen in de RNA-genexpressie.
Conclusies
- De snelle in situ hybridisatiemethode is effectief voor met paraformaldehyde gefixeerd hersenweefsel.
- Deze benadering kan verdere studies naar genexpressie in de neurowetenschappen faciliteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere onderzoeken naar diverse neurologische aandoeningen omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Snelle in situ hybridisatie met oligonucleotiden-sondes op met paraformaldehyde gefixeerd hersenweefsel maakt een efficiënte, kwantitatieve beoordeling van veranderingen in genexpressie in ziekte-relevante modellen mogelijk. Dit gestroomlijnde protocol vermindert de complexiteit van de workflow en de doorlooptijd, wat bijdraagt aan een betrouwbare targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in neurofarmacologische pijplijnen. De aanpak verbetert de besluitvorming over portfolio's door reproduceerbare, schaalbare mRNA-kwantificering in preklinische studies mogelijk te maken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van veranderingen in genexpressie mogelijk als reactie op farmacologische interventies.
- Ondersteunt functionele validatie van targets, zoals 5-HT2A-receptoren, in ziekterelelevante hersengebieden.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door kwantificering van mRNA-modulatie na blootstelling aan verbindingen.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van neuropsychiatrische targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare, kwantitatieve uitlezing van de mRNA-expressie in geprefixeerde weefselcoupes.
- Verkort de tijd voor assay-ontwikkeling door de behoefte aan vers ingevroren monsters en radioactieve probes te elimineren.
- Maakt standaardisatie en schaalbaarheid mogelijk voor het screenen van de effecten van verbindingen op genexpressie.
- Ondersteunt een betrouwbare vergelijking tussen experimentele en controlegroepen voor assay-validatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante modellen door de expressie van het doelgen in hersenweefsel na toediening van het geneesmiddel te kwantificeren.
- Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door gebruik te maken van breed beschikbare geprefixeerde monsters.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve moleculaire eindpunten.
- Levert translationele biomarkergegevens voor modulatie van de serotonerge route.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinische fase door snelle, kwantitatieve analyse van genexpressie in paraformaldehyde-gefixeerde weefsels mogelijk te maken, wat zowel targetvalidatie als mechanistische studies ondersteunt.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten en het verduidelijken van pathways door mRNA-veranderingen na farmacologische interventie te meten.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt digitale kwantificering van mRNA-signalen met behulp van Image J, wat robuuste statistische vergelijkingen ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Koppelt moleculaire veranderingen aan ziekterelateerde fenotypes in preklinische modellen.
- Bedrijfbrede hergebruik: Biedt een breed toepasbaar protocol voor genexpressieanalyse binnen neurowetenschappelijke R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows met niet-radioactieve probes en compatibiliteit met gefixeerd weefsel.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en de verdere ontwikkeling van neurofarmacologische assets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, sonde-ontwerp en digitale beeldanalyse.
- Vereist toegang tot hybridisatie-ovens, beeldvormingssystemen en analysesoftware zoals Image J.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare kwantificering en datainterpretatie.
- Aanpasbaar aan verschillende genetische targets en hersenregio's met behulp van gevalideerde oligonucleotidesondes.
- Beperkt tot met paraformaldehyde gefixte weefsels; niet geschikt voor alle methoden van weefselconservering.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Dehydration and Pretreatment
3:32
Hybridization and Amplification
5:35
Signal Detection
6:20
Image Particle Analysis
7:31
Results: A Light Microscopic View of Hybridization Signals and the Effect on Hypothalamic htr2a Expression in Rats Treated with MDMA
8:16
Conclusion
