Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Het algemene doel van deze procedure is om de hoeveelheid van een specifiek MRNA van tumorcellen in de long te detecteren, als methode voor het analyseren van metastase. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een kwantitatief maatstaf voor metastase is. Om een longtumordissectie uit te voeren, plaatst u de muis na het euthanaseren met een dodelijke dosis isofluorine volgens het tekstprotocol, op een schuimbord op zijn rug met de ledematen gespreid, en gebruikt u dissectienelden om het aan het bord te bevestigen.

Nadat u ethanol heeft gebruikt om de muis te besproeien, gebruikt u een pincet om het onderste deel van het dier in het midden vast te grijpen en snijdt u met een schaar omhoog naar de nek door de huid, zorgvuldig zonder de buikholte van de muis te doorboren. Grijp nu het peritoneum aan het onderste uiteinde van het dier en begin omhoog te snijden naar de basis van de nek. Snijd voorzichtig langs de linker- en rechterkant van de ribbenkast, zorg ervoor dat u geen bloedvaten doorbreekt die kunnen bloeden in de borstholte.

Verwijder de ribben door naar links en rechts te snijden, door het middenvlies en de bovenste delen van de ribbenkast. Gebruik vervolgens een pincet om de luchtpijp van de muis vast te grijpen en trek naar voren, en gebruik dissectiescharen om de luchtpijp door te snijden voordat u de longen uit de muis verwijdert. Gebruik PBS om het longweefsel voorzichtig te wassen.

Vervolgens, na een grove evaluatie van het longweefsel volgens het tekstprotocol, als de longen onmiddellijk moeten worden geanalyseerd, gaat u door met RNA-isolatie. Om RNA uit weefsel te isoleren, begint u met het homogeniseren van het weefsel met een van de methoden die in het tekstprotocol zijn vermeld. Bereid lysisbuffer van een RNA-isolatiekit voor en voeg 20 microliter tumor captoethanol toe aan elke milliliter lysisbuffer.

Suspenseer elke 30 gram weefsel in 300 microliter lysisbuffer en soniceer het weefsel gedurende 10 seconden met een sonicator ingesteld op 30% amplitude. Voeg 10 microliter protinase K toe aan 590 microliter TE-buffer en voeg 600 microliter van de buffer toe aan 300 microliter soniceraad weefsel. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij meer dan of gelijk aan 13.000 keer G om het puin te verwijderen. Breng vervolgens het supernatant over naar nieuwe buisjes. Voeg 450 microliter ethanol toe aan elke 900 microliter supernatant om het RNA te laten bezinken.

Breng vervolgens 700 microliter van de lysate ethanol mix over naar een RNA-kolom. Draai opnieuw gedurende 1 minuut bij meer dan of gelijk aan 13.000 keer G om het RNA aan de kolom te binden. Gooi vervolgens het vloeibare afval weg en voeg het resterende supernatant toe aan de kolom en draai opnieuw.

Voeg vervolgens 350 microliter wasbuffer een toe aan het bovenste deel van de kolom en centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden. Gooi het vloeibare afval weg en plaats de kolom terug in de buis. Bereid DNase voor door vijf eenheden DNase enzym één te mengen met vijf microliter 10X DNase buffer en 40 microliter DNase RNase vrij water voor elk monster.

Voeg 50 microliter DNase mix toe aan elke kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens 350 microliter wasbuffer een toe aan de kolommen en centrifugeer de monsters gedurende 30 seconden. Nadat u het afvaloplossing hebt weggegooid, voegt u 600 microliter wasbuffer twee toe en draait u nog eens 30 seconden.

Gooi het vloeistof weg voordat u 250 microliter wasbuffer twee toevoegt en draait gedurende twee minuten. Breng de kolom over naar een nieuw verzamelbuisje en voeg 50 tot 100 microliter RNase DNase vrij water toe aan de kolom. Na incubatie gedurende één minuut, draai gedurende één minuut.

Laat het verzamelde eluaat opnieuw door de kolom lopen om de RNA-opbrengst te verhogen. Voor onmiddellijk gebruik, bewaar de monsters op ijs. Voor later gebruik, snap freeze op droog ijs of vloeibare stikstof en bewaar op minus 80 graden Celsius tot het nodig is.

Gebruik een spectrofotometer om het RNA te kwantificeren. Vervolgens, in steriele RNase DNase vrije PCR-buisjes of platen, gebruik 0,5 tot 2 microgram totaal RNA om de reactiemix voor eerste transynthese voor te bereiden, zoals getoond in deze tabel. Meng en centrifugeer voorzichtig, en programmeer een standaard PCR-machine met behulp van het hier getoonde programma.

Wanneer de reactie voltooid is, gebruik steriele, nuclease-vrije water om de voltooide reactie te verdunnen tot het gewenste volume. Gebruik voor realtime PCR een positieve controle C DNA, zoals menselijk HER2, om een standaardcurve voor elke primerset op te zetten door een tot vier seriële verdunningen van de C DNA voor te bereiden om vijf standaarden te genereren. Bereken vervolgens het aantal totale monsters, dat de standaardcurve en experimentele monsters moet omvatten.

Vervolgens, in steriele RNase DNase vrije buisjes, bereid een mastermix voor voor elk experimenteel gen van belang, evenals een interne controle, zoals gapdh. Bereid een testplaat voor met één microliter C DNase voor elke standaard of experimentele monster. Wijs ten minste één C DNA-monster toe per putje, voor elke primer sonde.

Voeg 19 microliter mastermix toe per putje, voor elke primer sonde. Dit bioluminescentie-experiment toont aan dat muizenlongen behandeld met ACT1, dat zich richt op het gap junction-eiwit Connexin 43, negatief lijken voor luciferase-activiteit, wat suggereert dat er geen tumorcellen in het weefsel zijn. Echter, analyse van H&E secties van het longweefsel toont micrometastasen die niet door luciferase werden verlicht, wat suggereert dat luciferase beeldvorming niet gevoelig genoeg is om lage aantallen tumorcellen te detecteren.

Hier getoond zijn de resultaten van een qRT-PCR-experiment, met behulp van een sonde specifiek voor HER2, om menselijk HER2 plus JIMT1-tumorcellen in longweefsel te detecteren van cellen die o