Ontwikkeling van een Backbone cyclisch peptide bibliotheek als potentieel antiparasitaire Therapeutics behulp van microgolfstraling

Het algemene doel van deze procedure is om een gefocuste backbone cyclische peptidomimetica bibliotheek met conformationele diversiteit te ontwikkelen met behulp van microgolfbestraling voor nieuwe anti-parasitaire therapieën. Deze methode kan helpen bij het ontwikkelen van nieuwe hulpmiddelen om specifiek eiwit-eiwitinteracties te targeten. Om deze procedure te starten, voegt u 2,5 milliliter van de gewenste aminozuur, één milliliter activator en 0,5 milliliter activatorbase toe aan een polypropyleen cartridge.

Plaats de cartridge in een geautomatiseerde microgolf synthesizer en laat de koppelingsreactie 300 seconden verlopen bij 25 watt en 75 graden Celsius. Zodra de reactie voltooid is, was de resin met zeven milliliter N, N-dimethylformamide, of DMF, gedurende 120 seconden op kamertemperatuur. Na het herhalen van de vorige stap vijf keer, voegt u zeven milliliter 20% piperidine in DMF met 0,1 molair 1-hydroxybenzotriazool, of HOBt, toe aan de polypropyleen cartridge en incubeer gedurende 30 seconden bij 45 watt en 75 graden Celsius.

Wanneer u klaar bent, laat u het reactiemengsel weglopen. Voeg vervolgens zeven milliliter 20% piperidine in DMF met 0,1 molair HOBt toe aan de polypropyleen cartridge en incubeer gedurende 180 seconden bij 45 watt en 75 graden Celsius. Na het weglopen van het reactiemengsel, was de resin met zeven milliliter DMF gedurende 120 seconden op kamertemperatuur.

Was vervolgens de resin met zeven milliliter dichloormethaan, of DCM, gedurende 120 seconden op kamertemperatuur. Voor anhydride koppeling, was de resin met zeven milliliter 1-methyl-2-pyrrolidinon, of NMP, gedurende 120 seconden op kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent, laat u het reactiemengsel weglopen.

Na het herhalen van de vorige stap drie keer, lost u 10 equivalenten van het corresponderende anhydride op in vijf milliliter NMP in een 50 milliliter polypropyleen buis. Voeg vervolgens één equivalent 4-Dimethylaminopyridine, of DMAP, en 10 equivalenten N, N-diisopropylethylamine, of DIEA, toe aan de oplossing. Voeg dit mengsel toe aan de resin en incubeer gedurende 300 seconden bij 25 watt en 75 graden Celsius.

Na het wassen van de resin met NMP, wast u het met zeven milliliter DMF gedurende 120 seconden op kamertemperatuur. Op dit punt, brengt u de resin over naar een polypropyleen cartridge voorzien van een dop plug en stopcock. Zodra de resin is gewassen met DCM, voegt u 15 tot 25 milliliter van een mengsel van 1% trifluorazijnzuur, 5% triisopropylsilaan en 94% DCM toe aan de polypropyleen cartridge per 1 gram resin.

Plaats de polypropyleen cartridge op een shaker en schud gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Hierna laat u de oplossing uit de polypropyleen cartridge weglopen door een vacuüm aan te brengen. Na het herhalen van de vorige stappen drie keer, wast u de resin met zeven milliliter DCM gedurende 120 seconden op kamertemperatuur.

Deze stappen zijn zeer belangrijk, omdat de trityl beschermende groepen in verschillende resinen gedeeltelijk gekliefd werden gevonden in de DCM-trifluorazijnzuur oplossingen. Het verwijderen van methyltrityl groepen is een langzaam proces dat meerdere wasbeurten vereist. In een 50 milliliter polypropyleen buis, lost u vijf equivalenten Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorfosfaat op in vijf milliliter dibroommethaan.

Voeg vervolgens 10 equivalenten DIEA toe aan de oplossing. Voeg het mengsel toe aan de DCM-gewassen resin en incubeer gedurende 300 seconden bij 25 watt en 75 graden Celsius. Was vervolgens de resin met zeven milliliter DCM gedurende 120 seconden op kamertemperatuur.

Na twee wasbeurten met DCM, brengt u de resin over naar een polypropyleen cartridge en wast u tweemaal met di-ethylether. Droog de resin in een vacuüm exsiccator bij kamertemperatuur gedurende minimaal drie uur over kaliumhydroxide. Voeg vervolgens 10 milliliter van een voorgekoelde trifluorazijnzuur kleavercocktail toe aan elke gram resin.

Plaats de polypropyleen cartridge op een shaker en schud gedurende 3 uur op kamertemperatuur. Hierna verzamelt u de kleaveroplossing door de resin te filteren in een 50 milliliter polypropyleen buis. Voeg 35 milliliter koude di-ethylether toe aan de buis.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.207 keer g bij vier graden Celsius. Giet vervolgens de etherlaag af. Voor de Kaiser test, bereidt u Oplossing A voor door 16,5 milligram kaliumcyanide op te lossen in 25 milliliter gedistilleerd water.

Verdun één milliliter van de oplossing met 49 milliliter peridine. Bereid vervolgens Oplossing B voor door één gram ninhydrine op te lossen in 20 milliliter ethanol. Bereid Oplossing C voor door 40 gram fenol op te lossen in 20 milliliter ethanol.

Nadat de oplossingen zijn bereid, brengt u een paar kralen van de resin over naar een testbuisje. Voeg drie druppels van elke oplossing toe aan het buisje en meng. Verhit vervolgens het testbuisje op een verwarmingsblok gedurende vijf minuten bij 110 graden Celsius.

Synthese van de backbone cyclische peptiden werd uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde microgolf synthesizer op vaste ondergrond volgens het FMOC, t-butyl protocol. Het product werd geanalyseerd door massaspectrometrie en de zuiverheidsgraad werd bepaald met behulp van HPLC. Biologisch screening toonde aan dat peptide pL1 actief was tegen Leishmania donovani, een parasiet die viscerale leishmaniasis veroorzaakt, de ernstigste vorm van leishmaniasis bij mensen.

Peptide pL1 verminderde de parasietlevensvatbaarheid met 75% vergeleken met de controlebehandeling. Zodra deze techniek is beheerst, kan deze in drie tot vijf dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling van deze techniek, heeft dit de weg geëffend voor onderzoekers in een breed scala aan velden om peptiden te verkennen als farmacologische regulatoren in fundamenteel onderzoek en therapieën.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moet