Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen
3 maart 2016
Hier beschrijven we een werkwijze voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn toegewijd aan de definitieve endoderm ter verbetering van downstreamtoepassingen en verdere onderverdelingen.
Het algemene doel van deze methode is het zuiveren van endodermale cellen die zijn gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen of ES-cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het stamcelveld over endodermdifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een zuivere populatie endodermcellen kan worden verkregen na het verwijderen van ongedifferentieerde cellen.
Voordat u met de procedure begint, bedekt u zes welborden voor celkweek met één milliliter basement membrane matrix per putje. Gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, om de menselijke ES-cellen te oogsten, aspireer het medium van een 80 tot 90% confluente menselijke embryonale stamcelcultuur met een steriele glazen Pasteur-pipet.
En was de cellen met twee milliliter PBS per putje. Schud de plaat en aspireer de zoutoplossing om de dode cellen en puin te verwijderen. Vervolgens dissocieert u voorzichtig de celclusters met één milliliter enzymvrij passageringsoplossingsreagens, bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat de cellen duidelijke tekenen van ontwrichting in kleinere clusters vertonen.
Na ongeveer zeven minuten, voegt u één milliliter DMMF12-medium toe aan de putjes. En pipet omhoog en omlaag een paar keer met een pipettip van één milliliter om de resterende celaggregaten te detacheren in een enkele celsuspensie. Gebruik dezelfde pipet om de cellen over te brengen naar een centrifugeerbuis en spoel de putjes met één milliliter vers DMMF12-medium, waarbij de spoelingen in de buis worden verzameld.
Na het afcentrifugeren van de cellen, resuspendeert u het pellet in vijf milliliter ES-celkweekmedium gesupplementeerd met ROCK-remmer. Tel de cellen en zaai 1,5:4 keer 10 tot de vijfde cellen per putje op de met basement membrane matrix beklede platen in kweekmedium gesupplementeerd met ROCK-remmer om apoptose te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende ongeveer 24 uur.
En gebruik vervolgens een steriele, glazen Pasteur-pipet om het medium in elk van de putjes te vervangen door 2 milliliter primitief streep inductiemedium. Na nog 24 uur kweek, vervangt u het medium door endoderm inductiemedium voor een 48-urige incubatie met dagelijkse mediumverversingen. Op de laatste kweekdag en ten minste een uur voordat u de cellen oogst, voegt u vers ROCK-remmer toe aan het kweekmedium.
Gebruik vervolgens een steriele, glazen Pasteur-pipet om het medium uit elk van de putjes te aspireren en de cellen te dissociëren met enzymvrije passageringsoplossingsreagens zoals zojuist is gedemonstreerd. Wanneer een enkele celsuspensie is bereikt, telt u de cellen en centrifugeert u ze. Zorg ervoor dat vanaf dit punt alle medium en buffers de ROCK-remmer bevatten om te voorkomen dat de cellen afsterven.
Anders zullen ze niet goed worden gehecht na het terugtrekken. Resuspendeer het pellet in 100 microliter PEB-buffer, gesupplementeerd met ROCK-remmer per 1 keer 10 tot de zevende cel. Voeg vervolgens CXCR4 APC-antilichaam toe aan de cellen.
Lichtjes flikkerend de buis om te mengen. Na 15 minuten bij 4 graden Celsius, was de cellen in één tot twee milliliter PEB-buffer en gebruik een steriele, glazen Pasteur-pipet om het supernatant te aspireren. Resuspendeer het pellet in 80 microliter PEB-buffer per 1 keer 10 tot de zevende cel en voeg 20 microliter anti-APC microbeads toe aan de cellen.
Meng het monster met lichtjes flikkeren. Bewaar de cellen vervolgens gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met één tot twee milliliter PEB-buffer gesupplementeerd met ROCK-remmer.
En resuspendeer het pellet in 500 microliter vers PEB-buffer plus remmer. Om de CXCR4+cellen te isoleren door magnetische parelkettingscheiding, laadt u een middelgrote magnetische kolom op een geschikte magneet en spoelt u de kolom vooraf met 500 microliter PEB-buffer plus ROCK-remmer. Wanneer al het wassen van de bovenkant van de kolom is weggedraineerd, brengt u het hele volume van het magnetische parelkettinglabel op de kolom aan, waarbij u de doorstroming in een conische buis verzamelt.
Was de kolom met drie toepassingen van 500 microliter PEB-buffer plus ROCK-remmer. Breng vervolgens de kolom van de magneet over in een geschikte opvangbuis. En dompel één milliliter PEB-buffer plus ROCK-remmer door de kolom om de CXCR4+cellen te verzamelen.
Optioneel kunnen alle doorstromende monsters afzonderlijk worden verzameld en kunnen 20 microliter aliquots van elk monster worden gebruikt om het percentage CXCR4+cellen in elke alouette te bepalen door middel van flowcytometrie. Deze procedure kan worden herhaald met de eerste doorstroming om cellen te verzamelen die niet aan de kolom hebben gebonden. Vervolgens worden zowel alle CXCR4+samples gepoold en gecentrifugeerd.
Ten slotte resuspendeer het pellet in één milliliter endoderm inductiemedium gesupplementeerd met ROCK-remmer En zaai de cellen met de juiste dichtheid in een met basement membrane matrix beklede celkweekcontainer. Voorafgaand aan hun differentiatie, drukken menselijke ES-cellen hoge niveaus van de pluripotentiemarker SOX2 uit. Terwijl de definitieve endodermmarker, FOXA2, niet wordt gedetecteerd.
Bij differentiatie ondergaan de ES-cellen drastische veranderingen in hun gen- en eiwitexpressie. Inderdaad, na vier dagen in differentiatiemedium, worden SOX17 en FOXA2 uniform in de kernen van veel van de voormalige ES-cellen co-geëxpresseerd, een kenmerk van definitieve endodermtoewijzing. Sommige cellen weerstaan het differentiatieproces en drukken geen van beide markereiwitten uit.
En houden in feite hun pluripotentiemarker SOX2-expressie. In dit representatieve experiment, op dag drie van differentiatie, drukte bijna 60% van de geoogste ES-cellen CXCR4 uit, waarvan de zuiverheid werd verrijkt tot meer dan 85% na magnetische parelkettingsortering van de pluripotente en andere ongewenste lijnagecellen. Na het zaaien van de gezuiverde CXCR4+cellen, worden slechts enkele SOX2+cellen gedetecteerd, waarbij de meerderheid van de gezaaide cellen FOXA2 tot expressie brengt.
Eenmaal onder
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het zuiveren van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen die zijn vastgelegd tot het definitieve endoderm. Deze techniek verbetert downstream-applicaties en verdere differentiaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcelbiologie
- Celldifferentiatie
- Endodermale ontwikkeling
Achtergrond
- Humaane embryonale stamcellen (ES-cellen) kunnen differentiëren tot diverse celtypen.
- Het begrijpen van endodermale differentiatie is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- De zuivering van specifieke celtypen ondersteunt onderzoek en therapeutische toepassingen.
- Huidige methoden leveren mogelijk geen zuivere populaties van gedifferentieerde cellen op.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het zuiveren van endodermale cellen uit menselijke ES-cellen.
- Het faciliteren van onderzoek naar endodermale differentiatie.
- Het verbeteren van de kwaliteit van downstream-applicaties waarbij deze cellen worden gebruikt.
Gebruikte methoden
- Coaten van celkweekplaten met basaalmembraanmatrix.
- Oogsten van humane ES-cellen uit kweek.
- Verwijderen van ongedifferentieerde cellen om zuivere endodermpopulaties te verkrijgen.
- Toepassing van steriele technieken gedurende de gehele procedure.
Belangrijkste resultaten
- Een zuivere populatie endodermale cellen is succesvol verkregen.
- De methode bleek effectief bij het differentiëren van menselijke ES-cellen.
- Kernvragen in het stamcelonderzoek met betrekking tot endodermale differentiatie zijn beantwoord.
- De techniek biedt een betrouwbare aanpak voor toekomstige studies.
Conclusies
- De purificatiemethode verbetert de studie van endodermale cellen.
- Het biedt een significante vooruitgang in de methodologieën voor stamcelonderzoek.
- Toekomstige toepassingen kunnen regeneratieve geneeskunde en ontwikkelingsstudies omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De zuivering van definitieve endodermcellen uit menselijke embryonale stamcellen pakt een kritieke flessenhals aan in differentiatieworkflows voor regeneratieve geneeskunde. Het verrijken van CXCR4+-populaties verbetert de getrouwheid van downstream-differentiatie richting pancreatische, hepatische of pulmonale lijnen. Deze methode ondersteunt doelwitvalidatie en assay-gereedheid door de lijnheterogeniteit in stamcel-afgeleide modellen te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar endodermale commitement mogelijk door CXCR4+ cellen te isoleren die FOXA2 en SOX17 co-expresseren.
- Operationele waarde: Verwijdert pluripotente en off-lineage contaminanten die de mechanistische interpretatie bemoeilijken.
- Predictieve waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van target engagement-studies door een homogeen definitief endoderm-substraat te leveren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een reproduceerbaar cellulair substraat voor compound-screening in endoderm-afhankelijke pathways.
- Operationele waarde: Standaardiseert de zuiverheid van het startmateriaal (>85% CXCR4+) om assay-variabiliteit te verminderen.
- Schaalbaarheid: Scheiding met magnetische beads maakt de verwerking van 10^7 cellen per run mogelijk, wat medium-throughput screening ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Gezuiverde CXCR4+-cellen dienen als een gedefinieerd startpunt voor differentiatie naar hepatocyten, bètacellen of longepitheelcellen.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert ruis veroorzaakt door residuele pluripotente cellen die in vivo teratomen zouden kunnen vormen.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Maakt een nauwkeuriger modellering mogelijk van weefselresponsen uit het endoderm op potentiële geneesmiddelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode sluit aan tussen de specificatie van het definitieve endoderm en de lijnspecifieke rijping, waardoor de overgang van discovery biology naar preklinische modellering mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van transcriptiefactornetwerken (bijv. FOXA2/SOX17) bij de commitment tot endoderm.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, lineage-verrijkte cellen voor compound-bibliotheekscreening in assays die door het endoderm worden gemedieerd.
- Analytics: Faciliteert qPCR- en immunocytochemische read-outs met een verminderde achtergrond door ongedifferentieerde cellen.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen in vitro differentiatie en preklinische validatie van uit het endoderm afgeleide celtherapieën.
- Herbruikbaarheid in de onderneming: Kolomgebaseerde magnetische scheiding is aanpasbaar voor meerdere protocollen voor endodermdifferentiatie.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de striktheid van de targetvalidatie door lineage-ruis in differentiatiemodellen te minimaliseren.
- Operationele waarde: Wordt in minder dan twee uur voltooid met standaardapparatuur voor magnetische scheiding.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de voorspellende betrouwbaarheid van endoderm-afhankelijke assays te verhogen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van verbindingen die gericht zijn op endoderm-afgeleide ziektemechanismen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek en flowcytometrie voor validatie.
- Afhankelijk van magnetische kolomsystemen en de beschikbaarheid van APC-geconjugeerde CXCR4-antilichamen.
- Noodzaakt de inclusie van een ROCK-remmer gedurende het hele proces om apoptose tijdens de zuivering te voorkomen.
- Aanpasbaar aan andere oppervlaktemarkers indien alternatieve endoderm-specifieke epitopen worden gevalideerd.
- Beperkt door de initiële differentiatie-efficiëntie; verrijkt doorgaans van ~60% naar >85% CXCR4+ cellen.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:34
Human ES Cell Differentiation toward the Definitive Endoderm
2:57
CXCR4+ Definitive Endoderm (DE) Cell Immunostaining for Flow Cytometric Analysis
4:55
CXCR4+ Cell Magnetic Bead Isolation
6:34
Results: Representative Changes in Gene/Protein Expression after Human ESC into DE Differentiation
7:59
Conclusion
