Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

Het algemene doel van deze geminiaturiseerde glycanarray is om de specificiteit en aviditeit van influenza A-virus hemagglutininen te analyseren. Deze test kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de binding en aviditeit van influenza A-virusreceptoren. Het grote voordeel van deze techniek is dat we binnen een enkele test zowel de specificiteit als de relatieve bindingsaviditeit kunnen bepalen, iets wat normaal niet mogelijk is met typische glycanarray- en plaatgebaseerde tests.

Dit protocol begint met de voorbereiding van de glycamonsters. De basisoplossing voor de glycanen is een stock-afdrukbuffer die, wanneer gemaakt, langzaam getitreerd moet worden tot een pH van 8,5 en vervolgens een toevoeging van oppervlakteactieve stof moet krijgen. Gebruik de bereide afdrukbuffer om de PAA-geconjugeerde glycanen te verdunnen tot 100 microgram per milliliter.

Verdun vervolgens de monovalente glycanen tot 100 micromolar ook in de afdrukbuffer. Maak ten slotte werkoplossingen van de amine-gefunctionaliseerde kleurstoffen op één micromolar. Laad nu tien microliter van elk glycamonster in een putje van een 384-wel-microtiterplaat.

Dit is genoeg oplossing om vijf slides af te drukken. Draag ook tien microliter van de kleurmarker af naar een putje van de afdrukplaat. Bereid de afdruk van de arrays voor door eerst de arrayer-pinnen en de afdrukkop te positioneren volgens het lay-out.

In dit geval kan één pen alle monsters afdrukken. De arrays van glycanen worden afgedrukt in blokken van zes, omgeven door een lege plek aan alle kanten. Trek handschoenen aan om de slides te hanteren.

Pak ze uit en blaas eventueel puin van hun oppervlakken met ultra-zuiver stikstofgas. Plaats vervolgens de slides met de beklede kant omhoog op de arrayer-stage. Programmeer vervolgens de arrayer.

Programmeer in dit geval 27 spots per bezoek aan de bronplaat. Drie vooraf geplaatste spots op het niet-arraygebied van een poly-L-lysine gecoate slide worden gebruikt om overtollig vocht aan de punt van de pen te verwijderen. De andere 24 spots per penbezoek worden gebruikt om zes spots in vier replicaatarrays te plaatsen.

Details worden gegeven in het tekstprotocol. Laad nu de multi-well platen in de printer en begin met het afdrukken van de arrays. Zorg er tijdens het afdrukken voor dat de luchtvochtigheid tussen 55 en 65% blijft. Let op het uiterlijk van de pre spots op de poly-L-lysine gecoate slides.

Inspecteer na het afdrukken elke slide visueel. Controleer op correcte uitlijning van de spots binnen de teflon randen, wat essentieel is, en controleer op het correcte aantal gespotde functies. Om de hechting van de stippen te homogeniseren, plaats de afgedrukte slides direct na het maken in een 100% vochtigheidskamer met hun bedrukte kant omhoog.

Gebruik natte papieren handdoeken om een container en een geïmproviseerd rek te bekleden. Wikkel de kamer in plastic om de vochtin te vangen. Verwijder na een half uur de slides.

Nummereer vervolgens de slides met een oplosmiddelbestendige marker en bewaar ze 's nachts in een droogkast. Bereid de volgende dag een verse voorraad blokkeerbuffer voor met krachtig roeren. Pas de pH aan op 9,2 met geconcentreerd natriumhydroxide.

Incubeer vervolgens de slides in de buffer gedurende een uur. Om de blokkering te verwijderen, spoel de slides af in twee keer gedistilleerd water. Draag vervolgens de slides over naar glazen kleurhouders en laad de houders in een draaiende plaathouder om de slides bij 10 G's gedurende vijf minuten droog te draaien.

Na het drogen, bewaar de slides indien nodig bij min 20 graden Celsius in verzegelde plastic zakken. Bereid ter voorbereiding een andere bevochtigingskamer zoals eerder. Bereid om de geïmmobiliseerde glycanen te detecteren, SNA en ECA gebiotineerde lectinen voor bij 10 microgram per milliliter in sondeverdunningsbuffer en voeg aan elke verdunning twee microgram per milliliter streptavidin 555 toe.

Maak een 20 microgram per milliliter oplossing van voorcomplex antilichaam in blokkeerbuffer in een vier-op-twee-op-een molaire verhouding zoals beschreven in het tekstprotocol om met de hemagglutininen te kleuren. Draag 20 microliter van de bereide oplossingen over naar putjes van een 384-wel plaat. Verdun vervolgens de lectinen en hemagglutininen serieel een-op-een in hun geschikte buffers.

Maak acht verdunningen, vul elk putje met 10 microliter monster en 10 microliter buffer. Bewaar vervolgens de plaat 30 minuten op ijs. Voeg nu acht microliter van elke verdunning toe aan één van de 48 microputjes op een afgedrukte slide.

Bewaar vervolgens de bereide slide gedurende 90 minuten in de bevochtigingskamer. Was na 90 minuten de slide terwijl u deze van de rand vasthoudt; dompel het vier keer onder in PBS-T, dompel het vervolgens vier keer onder in PBS en tenslotte vier keer onder in gedeïoniseerd water. Droog de slide vervolgens opnieuw op zoals eerder.

Scan de slide onmiddellijk na het drogen. Zorg ervoor dat u de slide voorzichtig in de juiste oriëntatie in de scanner laadt. Gebruik een lage laservermogen van vijf milliwatt en scan de slides iteratief, waarbij u geleidelijk het vermogen verhoogt van 25 tot 75% Terwijl u de scaninstellingen optimaliseert, houd er rekening mee dat de fluoroforen bij herhaalde scans verbleken.

Analyseer de opgeslagen afbeelding voor bindingssignalen met behulp van de bijbehorende software. Een arraylijst kan worden geladen die het afdrukpatroon heeft. Leg deze over de scan om de plaatsing van de rastermarkeringen te helpen navigeren.

Gebruik vervolgens de software om de spotintensiteiten te analyseren en sla de resultaten op als een tab-gescheiden tekstbestand om te exporteren naar een spreadsheet of ander statistisch pakket. Analyseer de gegevens door de gemiddelde signaalintensiteit min de achtergrond te berekenen. Neem een gemiddelde van vier van de zes replicaatspots voor elk monster, waarbij u het hoogste signaal en het laagste signaal weg laat.

Maak vervolgens een lijngrafiek van de gemiddelde gemiddelde signaal min de