Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy
16 maart 2016
Hoewel de structuur van ribosomen uitgebreid is gekarakteriseerd, is de organisatie van polysomen nog onvoldoende bestudeerd. Om dit kennisgebrek te overwinnen, presenteren we hier een gedetailleerd voorbereidingsprotocol voor nauwkeurige beeldvorming van polysomen van zoogdieren door atomaire krachtmicroscopie (AFM) in lucht en vloeistof.
Het algemene doel van dit protocol is om een gedetailleerde pijplijn te bieden voor de nauwkeurige zuivering en depositie van hersenpolyribosomalen op mica en om duizenden beelden op nanoschaalresolutie te verkrijgen zonder de noodzaak van zware post-verwerking of 3D-reconstructieanalyses. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van translatie en translationele controle, zoals het begrijpen van de impact van ribosoomorganisatie binnen polysomen tijdens het herprogrammeren van genexpressie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat er geen monsterfixatie of labeling vereist is, en metingen kunnen worden uitgevoerd onder bijna fysiologische omstandigheden om de ribosomen en naakte RNA-strengen gemakkelijk te identificeren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de organisatie van zoogdierpolyribosomen, kan deze ook worden toegepast op andere micro-organismen, zoals gist, bacteriën en insecten, evenals status die betrekking heeft op translationele controle van genexpressie. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het hanteren van polysomale monsters voor absorptie van mica en de wasstappen vrij lastig zijn en vaardigheden en ervaring vereisen. De procedure wordt gedemonstreerd door Paola Bernabo en Lorenzo Lunelli.
Begin met het verzamelen en invriezen van hersenweefsel zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Trek vervolgens het bevroren weefsel uit de vriezer en breng het naar de werkbank. Plaats het bevroren hersenweefsel en vloeibare stikstof in een voorgekoelde mortel en verpulver het met een stamper tot het een poeder vormt.
Breng ongeveer 25 milligram van het hersenpoeder over naar een koude microcentrifugebuis en voeg onmiddellijk 0,8 milliliter lysbufer toe. Pipetteer het mengsel 25 keer snel op en neer om de cellen te verstoren. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende één minuut bij 12.000 x g en vier graden Celsius om het cellulaire debris te bezinken.
Breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis en houd de buis gedurende 15 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende vijf minuten om kernen en mitochondriën te bezinken. Vervolgens zorgvuldig één milliliter verwijderen vanaf de bovenkant van een eerder bereide sucrosegradiënt.
Leg de sucrose druppel voor druppel bovenop de gradiënt met het supernatant van het cytosolische lysate. Met het monster nu bovenop de gradiënt, laat de buis en een tegengewichtbuis voorzichtig zakken in de emmers van een zwevende emmer rotor. Centrifugeer de gradiënt gedurende 100 minuten.
Laat de buizen na ultracentrifugatie 20 minuten in hun emmers staan bij vier graden Celsius om de gradiënt te laten stabiliseren. Verwijder vervolgens voorzichtig de monsterbuis en monteer deze op het verzamelapparaat van een dichtheidsgradiënt fractieringssysteem. Verzamel een milliliterfracties terwijl u de absorptie van nucleïnezuren bij 260 nanometer monitort met een UV zichtbaar lichtdetector en zet ze op ijs.
Bereid vervolgens 30-40 microliter aliquoten van de interessante fracties en bewaar ze op ijs. Als de monsters niet meteen worden gebruikt, bewaar ze dan bij 80 graden Celsius en neem maatregelen om het aantal bevriezing-ontdooicycli te beperken. Om monsters voor AFM-beeldvorming voor te bereiden, bedek eerst een gewassen micaplaat met 200 microliter één millimolair nikkel II-sulfaat en incubeer de plaat drie minuten bij kamertemperatuur.
Verwijder vervolgens de oplossing, droog het oppervlak af met perslucht en plaats de petrischaal op ijs. Voeg vervolgens voorzichtig het hele aliquot van de interessante fractie druppel voor druppel toe op de mica. Verspreid met een 100 of 200 microliter tip het monster over het hele oppervlak van de mica en incubeer het monster gedurende drie minuten op ijs.
Bedek vervolgens de micaplaat druppel voor druppel met 200 microliter koude buffer AFM en incubeer het monster gedurende één uur op ijs. Het belangrijkste is om het monster op 40 graden te houden en koude buffer te gebruiken die in RNase-vrij water is bereid om de organisatie van polyribosomalen te behouden. Na incubatie verwijdert u voorzichtig de buffer en wast u de mica drie tot vier keer met 200 microliter koude buffer AFM om eventuele overtollige sucrose te verwijderen.
Was vervolgens de mica drie keer met koude wasoplossing en laat het overtollige water uit de mica lopen met papier. De volledige verwijdering van sucrose uit de absorberende monsters is cruciaal nu u zowel het ribosoom als naakt RNA in het polysoom hebt afgesneden. Laat het monster onder de chemische kap drogen met de bovenkant van de petrischaal gedeeltelijk geopend.
Na twee uur sluit u de petrischaal. Het monster kan nu bij kamertemperatuur worden bewaard. Bevestig het voorbereide monster aan de monsterhouder van de AFM met dubbelzijdig plakband.
Plaats vervolgens de monsterhouder in de AFM-fase volgens de instructies van de fabrikant. Na calibratie nadert u het monster totdat de cantilevertip in contact komt met het oppervlak. Selecteer een scangebied van twee bij twee micrometer, een resolutie van minimaal 512 x 512 pixels, kies de modus voor live achtergrondafschrijving en selecteer een Z-schaal van 20-25 nanometer.
Begin vervolgens met beeldacquisitie. Inspecteer het beeld en kijk naar de aanwezigheid van ronde objecten die worden gekenmerkt door een hoogte tussen de 10 en 15 nanometer bij het maken van beelden in de lucht. Pas vervolgens de setpoint en feedbackparameters aan totdat scherpe objecten worden gevisualiseerd.
De achtergrond zou relatief vlak moeten zijn in goede monsters met enkele objecten van twee tot vier nanometer hoog. Zodra het beeld er goed uitziet, verwerft u verschillende twee bij twee micrometer scans op verschillende monstergebieden. Na de depositie van sucrose-aliquots op mica, biedt AFM nauwkeurige groottebeschrijvingen van enkele polysomen die verschijnen als clusters van strak gepakte ribosomen.
Een nadere blik op een van de ribosoompieken met behulp van dwarsdoorsnedeanalyse onthult dat de hoogte van de ribosoompieken ongeveer 14 nanometer is. Dit komt overeen met wat eerder we
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het afbeelden van mammaliaanse polysomen met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). De methode maakt resolutie-rijke beeldvorming mogelijk zonder dat monsterfixatie of labeling noodzakelijk is.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- De organisatie van polysomen is onvoldoende onderzocht, ondanks de uitgebreide karakterisering van de ribosoomstructuur.
- Inzicht in de organisatie van ribosomen is cruciaal voor het begrijpen van de regulatie van genexpressie.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse organismen, waaronder gist en bacteriën.
- Een visuele demonstratie is essentieel vanwege de complexiteit bij het hanteren van polysomale monsters.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor de zuivering en beeldvorming van cerebrale polyribosomen.
- Om de studie naar translationele controle en genexpressie te faciliteren.
- Om beeldvorming onder bijna-fysiologische omstandigheden mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Atomic force microscopy (AFM) voor beeldvorming.
- Zuivering van hersenpolyribosomen op mica.
- Beeldvorming zonder uitgebreide nabewerking of 3D-reconstructie.
- Hanteringstechnieken voor monsterabsorptie en wassen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van polyribosomen met nanoschaalresolutie.
- Identificatie van ribosomen en naakte RNA-strengen in monsters.
- Inzichten in de organisatie van polyribosomen bij zoogdieren.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van translationele controles in verschillende organismen.
Conclusies
- Het protocol vergroot het begrip van de ribosoomorganisatie in polysomen.
- Het biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die genexpressie bestuderen.
- De toepasbaarheid van de methode op diverse organismen vergroot de impact ervan.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Inzicht in de organisatie van polysomen biedt mechanistische inzichten in de translationele controle, een cruciale laag van genexpressieregulatie die relevant is voor targetvalidatie in programma's voor neurowetenschappen en metabole ziekten. De mogelijkheid om polysomen af te beelden onder bijna-fysiologische omstandigheden zonder fixatie of labeling maakt een reproduceerbare, kwantitatieve analyse van ribosoomdynamiek mogelijk, wat vroege hypothesetoetsing en biologische risicoreductie ondersteunt. Deze aanpak biedt een complementaire, labelvrije methode om translationele toestanden in ziekterelateerde systemen te beoordelen, wat helpt bij de prioritering van targets met een sterke mechanistische onderbouwing.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe visualisatie van de ribosoomorganisatie mogelijk om translationele hypothesen te onderzoeken en effecten op pathway-niveau van genetische of farmacologische perturbaties te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare, labelvrije imaging-readout die de variabiliteit vermindert die gepaard gaat met fixatie- of kleuringsartefacten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van veranderingen in de translationele status als functionele biomarker voor target engagement en het werkingsmechanisme.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaar voor assay: Genereert kwantitatieve polysoombeeldgegevens die geschikt zijn voor high-content-analyse van het aantal en de distributie van ribosomen.
- Reproduceerbaarheid: Maakt het mogelijk om duizenden beelden met nanoschaalresolutie onder consistente omstandigheden te verkrijgen, wat statistische robuustheid mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met fractioneringsworkflows die kunnen worden aangepast aan screeningcampagnes met meerdere monsters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Toepasbaar op hersenweefsel, wat directe studie van de polysoomorganisatie in neurodegeneratieve en neuropsychiatrische ziektemodellen mogelijk maakt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en ex vivo hersensystemen, wat mechanistische risicoreductie ondersteunt vóór in vivo validatie.
- Intersoortelijke bruikbaarheid: Kan worden uitgebreid naar gisten, bacteriën en insecten, wat conservatiestudies en targetvalidatie over verschillende modelorganismen heen mogelijk maakt.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-hypothesevalidatie tot mechanistische risicoreductie, en levert biofysische gegevens over de organisatie van de translationele machinerie die complementair zijn aan genomische en proteomische benaderingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door veranderingen in de polysoomstructuur te koppelen aan translationele controle tijdens de herconfiguratie van genexpressie.
- Analytica: Maakt het mogelijk om kwantitatieve metrieken te extraheren, zoals het aantal ribosomen per polysoom en de ruimtelijke distributie, wat vergelijkende analyses tussen verschillende condities faciliteert.
- Bedrijfsmatige Herbruikbaarheid: Vertegenwoordigt een herbruikbare imaging-capaciteit voor het bestuderen van translationele dynamiek in diverse ziekterelateerde systemen zonder gebruik van reagensafhankelijke labeling.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in translationele controle door directe observatie van de polysoomarchitectuur op nanoschaal mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak van fixatie, labeling of intensieve nabewerking, waardoor de workflow wordt gestroomlijnd en de variabiliteit wordt verminderd.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door vroege structureel-functionele inzichten te bieden in target-gemedieerde translationele effecten.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van het gevalideerde translationele mechanisme in ziekterelevante weefsels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in polysoomzuivering, dichtheidsgradiëntfractionering en de bediening van AFM.
- Afhankelijk van toegang tot ultracentrifugatie, AFM-instrumentatie en de bereiding van RNase-vrije buffers.
- Vereist gestandaardiseerde monsterbehandeling om een consistente depositie op mica en het behoud van de natuurlijke polysoomstructuur te waarborgen.
- Er moet rekening worden gehouden met weefselspecifieke variabiliteit in de opbrengst en stabiliteit van polysomen, in het bijzonder bij post-mortem of bevroren hersenmonsters.
- Beperkt door de noodzaak van gespecialiseerde training in monsterbereiding en AFM-imagingtechnieken, zoals vermeld in de vereisten voor de procedurele demonstratie.
