Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie
7 april 2016
De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.
Het algemene doel van deze procedure is om time-lapse analyse van diverse ontwikkelingsprocessen mogelijk te maken met behulp van een fluorescent dissecting microscoop met eenvoudige strategieën voor heruitlijning na drift in elke richting. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de ontwikkelingsbiologie te beantwoorden, omdat het directe observatie van weefsels en orgaanontwikkeling in levende embryo's gedurende meerdere uren mogelijk maakt. Het grote voordeel van deze methode is dat het een betaalbare en gemakkelijke alternatief is voor complexere technieken die normaal gesproken worden gebruikt voor time-lapse opnames van zich ontwikkelende weefsels en organen, zoals laser scanning of verlichte microscopie.
Hoewel deze methode inzichten kan geven in ruimtelijke en temporele veranderingen die plaatsvinden tijdens de ontwikkeling van veegvis embryo's en larven, kan het ook worden toegepast om vroege ontwikkelingsprocessen en andere modelorganismen te onderzoeken. Bovendien is het geschikt om dynamische processen in volwassen organismen te observeren, zoals wortel genezing en regeneratie. In voorbereiding, identificeer zeer reproductieve volwassen vissen uit de transgene GFP-expresserende lijn.
De avond voor de plant micro-injectie, zet vijf mannelijk-vrouwelijk paar reproductieve vissen in vijf kweekcontainers. In de containers, houd het mannetje en het vrouwtje gescheiden door een verwijderbaar zeefje gedurende de nacht. De volgende ochtend, net nadat het licht aangaat, zet een mannetje en een vrouwtje samen boven het zeefje, wat zal voorkomen dat ze hun eieren opeten.
Nu, observeer de vissen terwijl ze paaien. Zodra het paar ongeveer 50 eieren heeft geproduceerd, scheid ze. Breng vervolgens de eieren over met behulp van een Pasteur pipette naar een petrischaal gevuld met embryowater voor een eerste ronde injectie.
Herhaal dit proces voor elk gekoppeld paar. Als er extra eieren nodig zijn, kunnen dezelfde paarvormingen meerdere keren bij elkaar worden gebracht en gescheiden. Voor de micro-injectie wordt de voorbereiding van schalen en injectienaalden op een vrij standaard manier uitgevoerd.
Details zijn te vinden in het tekstprotocol. Begin met het laden van een voorbereide injectienaald. Gebruik een micro-loader tip om de naald terug te vullen met twee microliters MO werkoplossing, en bevestig vervolgens de naald in een micro-manipulator.
Vervolgens kan de naaldtip worden geopend. Terwijl u het bekijkt met de dissectiemicroscoop, gebruik pincetten om het uiteinde open te knijpen, of duw de punt tegen een stijve ondergrond. Vervolgens kalibreert u het injectievolume door de MO oplossing in een druppel mineraal olie op een raster te injecteren.
Pas de injectie aan om 75 micron druppels te maken die overeenkomen met ongeveer 200 picoliter oplossing. Bereid vervolgens de embryo's voor om te worden geïnjecteerd. Schik de ongeveer 21 celstadium embryo's langs de groef van de micro-injectieschaal met de vegetatieve pool gericht naar de benadering van de micro-injectienaald, die onder een hoek van 45 graden van de groef staat.
Nu, injecteer de embryo's. Met de naald, doorboor het chorion en het dooier, en injecteer vervolgens de geladen Morpholino oplossing in de dooier. Dit werkt voor embryo's in het stadium van één of twee cellen.
Na het injecteren van alle embryo's, gebruik een brede bore Pasteur om ze te verzamelen. Breng de geïnjecteerde embryo's over in petrischalen gevuld met embryowater en incubeer ze bij 28,5 graden Celsius. Later in de middag, siphon dode embryo's weg en vervang het embryowater.
De volgende ochtend, nadat de embryo's door gastrulatie heen zijn gegaan, remmen hun melanisatie door hun water te vervangen door embryowater dat een spoorhoeveelheid PTU bevat. Wees voorzichtig, PTU zal de juiste ontwikkeling voorafgaand aan gastrulatie verstoren. Later, op het gewenste ontwikkelingsstadium, dechorionate de embryo's met scherpe pincetten.
Gebruik de microscoop om het chorion vast te grijpen met één paar pincetten, en probeer de andere kant van het chorion vast te grijpen met een tweede paar pincetten. Trek vervolgens voorzichtig de pincetten uit elkaar zonder het embryo te verstoren. Vervolgens anesthetiseer de embryo's met Tricaine, en ga verder met het inbedden van de embryo's en agarose op een 15 micron herplaatsingsraster geplaatst in een dekglasbodem micro-schaal.
Laad vervolgens één milliliter aliquots van gesmolten agarose in 1,5 milliliter reactiebuisjes. Zet de buisjes in warmteblokken ingesteld op 36 graden Celsius, en wacht tot ze afkoelen. Breng vervolgens een embryo over naar de micro-schaal met behulp van een breed buisje.
Siphon het overtollige embryowater af en leg de embryo over met agarose. Terwijl de agarose nog vloeibaar is, gebruik twee kleine pipettenpunten om de embryo's te oriënteren. Positioneer de structuur van belang, in dit geval de pronefros, zo dicht mogelijk bij de glazen bodem, en in de nabijheid van het raster.
Het raster mag niet over de structuur van belang liggen. Het is voordelig om maximaal vier embryo's in verschillende micro-schalen in te bedden, en plan om de beste te beeld te maken. Goed inbedden vereist enige oefening.
Terwijl de agarose nog vloeibaar is, moet het embryo in een gewenste positie worden georiënteerd. Als het een pronefros is, dicht bij de glazen bodem, en op een geschikte afstand tot het herplaatsingsraster. Controleer de agarose routinematig.
Zodra het hard genoeg is om de embryo's vast te houden, laat het nog twee tot drie minuten bezinken. Leg vervolgens de ingebedde embryo over met embryowater dat sporen van PTU en tricaine bevat. Decanteer of siphon het overtollige embryowater af en sluit het deksel om verdamping te voorkomen.
Het resultaat mag geen luchtbellen bevatten. Het embryo kan nu worden afgebeeld met de glazen bodem naar de objectieve lens. Gebruik de voorbereiding om time-lapse beelden te maken, bijvoorbeeld door periodiek Z-stack beelden te maken gedurende meerdere uren, het is noodzakelijk om te corrigeren voor focale drift.
Als het mogelijk is, pas een auto-focus strategie toe. Schakel de auto-focus optie in de software control in. Kies voor
Overzicht
Deze methode maakt time-lapse-analyse van de orgaanontwikkeling in zebravissenembryo's mogelijk met behulp van een fluorescentiedissectiemicroscoop. Hiermee kunnen weefsels en de orgaanontwikkeling gedurende meerdere uren direct worden waargenomen, wat inzicht biedt in de ontwikkelingsbiologie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Zebravis-embryologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Time-lapse-beeldvorming is essentieel voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- Traditionele methoden kunnen complex en kostbaar zijn.
- Deze methode biedt een eenvoudiger en betaalbaarder alternatief.
- Het kan worden toegepast op diverse modelorganismen.
Doel van de studie
- Om de observatie van orgaanontwikkeling in levende embryo's te vergemakkelijken.
- Om een methode te bieden die gebruiksvriendelijk en kosteneffectief is.
- Om onderzoekers in staat te stellen dynamische ontwikkelingsprocessen te bestuderen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van volwassen zebravis voor de fokkerij.
- Micro-injectie van Morpholino-oplossingen in embryo's.
- Inbedding van embryo's in agarose voor beeldvorming.
- Time-lapse beeldvorming met een fluorescentie-dissectiemicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle observatie van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's.
- De effectiviteit van de methode voor time-lapse-beeldvorming is aangetoond.
- Inzichten verschaft in ruimtelijke en temporele veranderingen tijdens de ontwikkeling.
- Toepasbaarheid aangetoond voor andere ontwikkelingsprocessen en organismen.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol instrument voor onderzoek in de ontwikkelingsbiologie.
- Het vereenvoudigt het proces van het observeren van levende embryo's in de tijd.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van diverse ontwikkelingsfenomenen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode biedt een toegankelijke benadering voor time-lapse imaging van organogenese in zebravisembryo's, waardoor directe observatie van ontwikkelingsprocessen mogelijk is zonder dat er complexe of dure microscopie-infrastructuur vereist is. Door longitudinale imaging van weefseldynamiek in een gewervelde modelorganisme te ondersteunen, faciliteert het targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanistische risicoreductie in discovery pipelines. De techniek biedt een kosteneffectief alternatief voor het genereren van kwantitatieve, reproduceerbare gegevens over morfogenetische gebeurtenissen die relevant zijn voor ziektemodellering en fenotypische screening.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar genfuncties bij nierontwikkeling mogelijk door het visualiseren van ruimtelijke en temporele veranderingen in de nefrogenese na wt1a knockdown.
- Operationele waarde: Ondersteunt hypothesetesten door directe visualisatie van de vorming van pronefrotubuli en de fusie van nefronprimordia in levende embryo's.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de beoordeling van de fenotypische ernst in morphant-modellen, wat helpt bij de evaluatie van de betrouwbaarheid van targets voor pathways van nierziekten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve z-stack en time-lapse read-outs van fluorescent gelabelde nierstructuren voor comparatieve analyse tussen controlecondities en verstoorde condities.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een fluorescentiedissectiemicroscoop met autofocus en relocatiegrids om drift te minimaliseren, wat de reproduceerbaarheid tussen verschillende imagingsessies verbetert.
- Assay-gereedheid: Levert gestandaardiseerde imaging-outputs die gebruikt kunnen worden om baseline-fenotypes vast te stellen voor compound-screening of studies naar genetische modificatoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt observatie mogelijk van geconserveerde ontwikkelingsprocessen in zebravissen, een ziekterelevant systeem voor het modelleren van menselijke nieraandoeningen.
- Mechanistische risicovermindering: Maakt het volgen van defecten in cellulaire migratie en tubulusmorfogenese mogelijk, wat inzicht biedt in off-target effecten of padspecifieke effecten van genetische perturbaties.
- Preklinische afstemming: Ondersteunt de overgang van ontdekking naar preklinische validatie door het vaststellen van dosis- of tijdsafhankelijke fenotypische read-outs.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor renale pathways waarbij dynamische weefselbeeldvorming inzicht geeft in het werkingsmechanisme en de fenotypische uitkomst.
- Discovery Biology: Ondersteunt de functionele validatie van targets zoals wt1a door real-time observatie van downstream ontwikkelingsgevolgen in een levend systeem mogelijk te maken.
- Screening: Genereert reproduceerbare fluorescentiegebaseerde read-outs die geschikt zijn voor het beoordelen van effecten van verbindingen op niermorfogenese in een vertebratencontext.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van tubuluslengte, primordiavorming en cellulaire lokalisatie over tijd, wat een objectieve vergelijking tussen experimentele groepen mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege ontwikkelingsfenotypen met orgaandysfunctie in een later stadium, ter ondersteuning van biomarker-gealigneerde beoordelingen van renale toxiciteit of herstel.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een schaalbare imaging-capaciteit die kan worden toegepast op meerdere ontwikkelingsmodellen en organsystemen met minimale reconfiguratie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-validatie door genetische perturbatie te koppelen aan waarneembare ontwikkelingsdefecten in een fysiologische context.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door hardwarematige driftcorrectie (autofocus, relocatiegrids) en gestandaardiseerde embryo-preparatie.
- Strategische waarde: Verhoogt de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door vroege, visuele bevestiging van pathway-modulatie in een whole-organism assay.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van de ernst en specificiteit van de in vivo waargenomen ontwikkelingsfenotypen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de houderij van zebravissen, micro-injectie en embryo-stadiëring voor een succesvolle toepassing.
- Afhankelijk van een fluorescentie-dissectiemicroscoop met z-stack functionaliteit en software die autofocus en herpositionering van de tafel ondersteunt.
- Standaardisatie van de agarose-inbedding en de oriëntatie van de embryo's is noodzakelijk om een consistente beeldkwaliteit tussen gebruikers en sessies te waarborgen.
- Aanpassing aan andere organen of modellen kan wijzigingen vereisen in transgene reporters, het tijdstip van injectie of de ontwikkelingsstadiëring.
- Praktische beperkingen omvatten een lagere doorvoer in vergelijking met geautomatiseerde systemen en de handmatige inspanning die nodig is voor driftmonitoring wanneer er geen autofocus wordt gebruikt.
