Cutane Chirurgische denervatie: een methode voor de Eis Testen op Zenuwen in muismodellen van huidziekte

Het algemene doel van deze procedure is om de invloed van zenuwen op normale en pathologische huid te onderzoeken. Deze methode kan worden gebruikt om kernvragen in de normale huidbiologie te beantwoorden, zoals de vraag of cutane zenuwen de homeostase en ziekte beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat intacte en gedeneuserveerde huidmonsters van hetzelfde dier kunnen worden vergeleken.

Een visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal, aangezien zenuwen moeilijk te herkennen kunnen zijn en het lastig is om ze te verwijderen met minimale schade aan het omliggende weefsel. Anestheseer eerst de muis en controleer met een teenknijptest of het juiste sedatievlak is bereikt. Bevestig daarnaast dat de muis een normale ademhaling en hartslag vertoont.

Plaats het dier nu op een warmtematte in een aseptisch chirurgisch gebied. Gebruik een elektrische trimmer om voorzichtig het haar te verwijderen van de dorsale zijde waar de biopsie zal worden genomen. Reinig vervolgens het geschoren gebied met Betadyne- en alcoholdoekjes.

Zorg ervoor dat alle haarknippers van de plek zijn verwijderd. Omtrek nu de biopsieplaats met een zwarte marker. Om longitudinale coupes van haarfollikels te verkrijgen, moet de langere zijde van de biopsie in anterieure naar posterieure richting parallel aan de dorsale middenlijn lopen.

Maak met een scalpel een volledig dikke excisie zonder de onderliggende spierfascia te beschadigen. De bloeding is doorgaans minimaal. Het biopsiemonster moet de epidermis, dermis, het subcutane vet en de panniculus carnosus bevatten.

Strijk het uitgesneden huidmonster plat op een droog papieren handdoekje, met de dermiszijde naar beneden. Trim het overtollige papieren handdoekje weg en bewaar het monster in koud TBS voor maximaal een uur als er andere monsters moeten worden verzameld. Hecht de biopsieplaats bij de muis met nylon hechtingen van 60, met een onderlinge afstand van ongeveer drie millimeter.

Houd de muis vervolgens in een herstelkooi in de gaten tot hij weer bij bewustzijn is. Gebruik analgetica in overeenstemming met de vastgestelde institutionele regels voor dierenwelzijn en volg hun richtlijnen als de muis tekenen van distress vertoont. Verwijder de hechtingen binnen zeven tot 10 dagen na de operatie.

Ga verder met het verwerken van de biopten voor histologie of whole-mount kleuring. Anestheseer het dier, scheer de gehele dorsale huid en reinig het gebied op een vergelijkbare wijze als bij de biopsieprocedure. Maak nu met een steriel scalpel een incisie langs de dorsale middellijn vanaf de basis van de nek tot ongeveer een halve centimeter boven de staart.

Trek met steriele stompe pincetten de huid aan de linkerzijde voorzichtig weg van de flank om het onderliggende weefsel zichtbaar te maken, vanaf de scapulaire vetkussens nabij de nek tot net boven het achterpootje. Identificeer nu de nervus cutaneus dorsalis onder een dissectiemicroscoop. Deze zijn zichtbaar als witte strengen die caudaal lopen door de doorschijnende fascia van de rompwand, waarna ze scherpe bochten maken en het losse bindweefsel onder de huid binnengaan.

Verwijder vervolgens, met behulp van ultrafijne pincetten, de zenuwen uitsluitend van de linkerzijde van het dier op de anatomische locaties T3 tot T12 door ze weg te trekken vanaf de plek waar de segmenten buigen bij de rompwand tot aan hun instippunten in de huid. Houd de pincet verticaal en pak de zenuwen vast op ongeveer een halve centimeter onder hun buigpunten. Trek ze na het vastpakken omhoog, zodat de zenuwen uitrekken en zich scheiden van het omliggende weefsel om ze vervolgens te verwijderen.

Voorkom beschadiging van de aangrenzende bloedvaten. Zorg ervoor dat het weefsel gedurende de gehele procedure vochtig blijft door periodiek druppels 0,9% steriele zoutoplossing aan te brengen. Ga door met het verwijderen van alle zenuwen die van de rompwand naar de huid lopen, maar beschadig de zenuwen binnen de dichte fascia van de rompwand niet.

Verwijder vervolgens alle zenuwen uit de blootgestelde huidflap. Deze vezels vormen de distale takken van de dorsale cutane zenuw en verschijnen als witte vertakkende strengen die sporadisch verspreid liggen in het bindweefsel aan de dermale zijde van de huidflap. Om deze fijne takken te verwijderen, plaatst u de pincet ongeveer parallel aan het dermale oppervlak, pakt u de zenuw vast en trekt u deze omhoog.

Verwijder op deze wijze alle zichtbare zenuwen. Prik niet door de bloedvaten en de huid. Tijdens deze stap is het belangrijk om te voorkomen dat naburige bloedvaten scheuren.

Als u een zenuw vindt met een aangrenzend bloedvat, volg deze dan tot een gebied waar geen aangrenzend vat aanwezig is en verwijder deze door deze eruit te trekken. Maak vervolgens de huid aan de rechterzijde van de incisie in de dorsale middellijn los, maar verwijder geen zenuwen. Dit dient als de contralaterale sham-operatieve controle.

Hecht ten slotte het dier en monitor postoperatief zoals voorheen. Om later, weken na de operatie, het stabiele verlies van zenuwen te bevestigen, prikt u voorzichtig in het gedenerveerde gebied met een steriele hypodermische naald. Let op of het dier reageert, gewoonlijk door te schudden of met het hoofd te draaien.

Indien het huidgebied stabiel is gedenerveerd, zal het dier weinig tot geen reactie vertonen. Neem huidbiopten uit het gebied zonder reactie en van de contralaterale sham-zijde voor matchende experimentele en controlemonsters. Vanuit de biopten is het belangrijk om meerdere histologische coupes te bemonsteren om potentiële verschillen in de abundantie of morfologie van tactiele koepels tussen de sham- en gedenerveerde specimens te identificeren.

De glebe one cree ERT2-muizenstam maakt het mogelijk om tamoxifen-geïnduceerde genetische recombinatie te richten op gebieden van de huid die een hoge activiteit van de hedgehog-signaalroute vertonen, zoals het epitheel van de tastkoepels. Deze muizen werden gekruist met induce abolaxi-reportermuizen om het epitheel van de tastkoepels te visualiseren. Noduli zijn cruciaal voor het behoud van zowel normale tastkoepels als de daarmee geassocieerde Merkelcellen.

Dit wordt experimenteel aangetoond door het geleidelijke verlies van de normale morfologie van de tastkoepel, evenals het verlies van keratin 8-deponerende cellen na denervatie. Zenuwen zijn daarnaast cruciaal voor het bevorderen van hedgehog-signalering in de tastkoepel, zoals gemonitord via Glebe 1 cree ERE2-expressies en home-mount beta collective sided-kleuringen van zowel schijn- als gedeneuverteerde huid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dorsale cutane zenuwen chirurgisch kunt ablateren om te testen of deze zenuwen betrokken zijn bij de normale huidfunctie of dat ze ziekten moduleren.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze routinematig en betrouwbaar worden uitgevoerd met minimale stress voor het dier. Na deze procedure kunnen methoden zoals amino-fluorescente kleuring worden gebruikt om te bevestigen of zenuwen volledig uit de huid zijn geablateerd en of de genexpressie is beïnvloed.