FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels
1 augustus 2016
Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor real-time celbiologie studies. Hier een werkwijze voor FRET beeldvorming cellen in fysiologische driedimensionale (3D) hydrogel microenvironments middels conventionele epifluorescentie microscopie wordt gepresenteerd. Een analyse voor ratiometrische FRET probes die lineaire verhoudingen over de activering bereik oplevert wordt beschreven.
Het algemene doel van deze experimentele methode is om realtime studie van intracellulaire signalering mogelijk te maken door middel van FRET-beeldvorming van cellen ingebed in driedimensionale hydrogels die natuurlijk weefsel nabootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingsbiologie, farmacologie en regeneratieve geneeskunde, zoals de ontwikkeling van optimale biomaterialen en hoogdoorvoerige geneesmiddelenscreening in geconstrueerde 3D-microweefsels. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat FRET kan worden gebruikt op een groot aantal cellen in verschillende hydrogeltypen met behulp van conventionele breedveldmicroscoopsystemen.
Na het fabriceren van mallen voor hydrogelgieten en het ophangen van gekweekte cellen in hydrogeloplossing, volgens het tekstprotocol, in een weefselkweekkap, voegt u de celbevattende voorloper toe aan de gietmallen met behulp van een steriele techniek. Voorafgaand aan het verknopen, centrifugeert u de cellen die zijn opgehangen in hydrogelvoorloper om de beeldvorming te optimaliseren door cellen te beperken tot een enkele brandpuntsvlak en het signaal buiten het vlak te minimaliseren. Vervolgens, om PC-hydrogels te verknoppen, gebruikt u een UVA-lichtbron gedurende een belichtingstijd gelijk aan 3,2 joule per vierkante centimeter per millimeter dikte om de celbevattende voorloper te bestralen.
Alternatief kunt u een goedkopere draagbare tandheelkundige lamp gebruiken. Vermijd overbelichting van de hydrogel, omdat dit de celviabiliteit zal verminderen. Fysiek verknoopte hydrogels worden in plaats daarvan op 37 graden Celsius geplaatst.
Na het verknopen verwijdert u de PDMS-hydrogelgietmal en vervangt deze door de eerder voorbereide PDMS-schaal. Gebruik een steriele spatel om de PDMS naar beneden op het glas te drukken om het te hechten. Voeg fenoolvrij serumvrij medium of een chemisch gedefinieerd medium toe aan de put gecreëerd in de PDMS-schaal met een dekglas om de hydrogel ondergedompeld te houden.
Incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Zodra de PDMS-schaal met de hydrogel is bevestigd op de microscoopstandaard en er olie op het objectief is aangebracht, gebruikt u doorgelaten licht om ten minste 15 cellen voor beeldvorming te vinden en bevestigt u de transfectie met fluorescentiebeeldvorming. Configureer in de microscoopsoftware de camera-instellingen voor de FRET-beeldkanalen door een paar cellen te kiezen in de buurt van het centrum van het gezichtsveld en optimaliseer de belichting en versterking per beeldkanaal volgens het tekstprotocol.
Kies cellen die dicht bij het centrum van de hydrogel liggen, binnen het relatief vlakke verlichtingsveld dat noch te helder noch te donker is, en met een FRET-verhouding tussen 00 en 1,0. Selecteer vervolgens meerdere gezichtsvelden om afbeeldingen te maken voor ten minste 15 getransfecteerde cellen. Schakel het licht uit wanneer u klaar bent om de blootstelling te beperken.
Om de opnamefrequentie voor tijd-lapse-beeldacquisitie te configureren, voert u de periodiciteit van de opnames in. Gebruik een snelle snelheid voor de basislijnsignaalopname, zoals elke vijf seconden per gezichtsveld, en een langzamere snelheid voor de daaropvolgende langetermijnsignaleringskinetiek. Selecteer Nu uitvoeren om de beeldacquisitie te starten en maak afbeeldingen gedurende vijf minuten om een basislijn voor de respons van de sonde op het aangewezen gezichtsveld vast te stellen.
Na de vijf minuten beeldacquisitie, pipet de gewenste agonist of antagonist, meng door te pipetten en ga door met beeldvorming. Na het uitvoeren van FRET-kalibratie volgens het tekstprotocol, selecteert u in de microscoopsoftware de pijl op het achtergrondgebied van belangstelling en kiest u Teken elliptisch achtergrondgebied van belangstelling. Teken en wijs één gebied van belangstelling, of ROI, per gezichtsveld aan in de buurt van de cellen om het achtergrondniveau te definiëren.
Zorg ervoor dat Behoud achtergrondoffset bijwerken is geselecteerd, activeer vervolgens het bekijken van het achtergrondgebied van belangstelling door op het pictogram Achtergrondgebied van belangstelling te klikken. Kies alternatief het pictogram Gebied van belangstelling en stel de eigenschappen van het gebied van belangstelling in als Gebruik als achtergrondgebied van belangstelling en Gebieden van belangstelling zijn anders in elke Multi Point. Gebruik het achtergrondpictogram van het gebied van belangstelling en selecteer Achtergrond aftrekken met behulp van het gebied van belangstelling.
Selecteer in het pop-upvenster, onder Achtergrondgebied van belangstelling aftrekken, Elke afbeelding en onder Toepassen op, selecteert u Alle frames. Voor elk gezichtsveld, om een gebied van belangstelling rond de cel te definiëren met behulp van het acceptoremissiekanaal en een binair masker, gebruikt u het menu Binair, Definieer drempel en selecteert u Toepassen op huidige frame. Pas vervolgens de onderste drempel aan om de cellen te selecteren.
Gebruik vervolgens de functie Binair sluiten om gaten in het binaire masker op te vullen, indien nodig. Gebruik vervolgens het pictogram Gebied van belangstelling om Binair naar gebied van belangstelling te kopiëren te selecteren om het binaire masker op te slaan als gebieden van belangstelling. Voeg de gebieden van belangstelling voor volgende gezichtsvelden toe aan de bestaande pool van gebieden van belangstelling.
Verwijder eventuele onjuiste gebieden van belangstelling. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de gebieden van belangstelling en controleer of hun eigenschappen Gebruik als standaard gebied van belangstelling zijn en dat de gebieden van belangstelling in elk Multi Point anders zijn. Celgebieden van belangstelling kunnen met de hand worden getekend, maar u moet ervoor zorgen dat onjuiste waarden worden verwijderd.
Het protocol bevat procedures voor cellen die zich buiten het vlakke verlichtingsveld bevinden en voor microscopen die geen vlak veld hebben. Centrifugatie van de hydrogelvoorlopers vóór gelatie maximaliseerde het aantal cellen op één brandpuntsvlak nabij het dekglas. Dit minimaliseerde achtergrondruis en verhoogde de beeldacquisitiesnelheid.
In dit FRET-experiment waren voor de berekening van de FRET-verhoud
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor Förster resonance energy transfer (FRET) imaging van cellen in driedimensionale hydrogel-micro-omgevingen. De techniek maakt real-time studies van intracellulaire signalering mogelijk en kan worden toegepast met behulp van conventionele epifluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Farmacologie
Achtergrond
- FRET-imaging is een waardevol instrument voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Driedimensionale hydrogels kunnen natuurlijke weefselomgevingen nabootsen.
- De methode maakt high-throughput analyse van meerdere cellen mogelijk.
- Conventionele microscopietechnieken kunnen voor deze benadering worden gebruikt.
Doel van de studie
- Om real-time observatie van intracellulaire signalering mogelijk te maken.
- Om de ontwikkeling van biomaterialen voor regeneratieve geneeskunde te faciliteren.
- Om drugscreeningprocessen in engineered micro-weefsels te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van mallen voor het gieten van hydrogelen.
- Suspensie van gecultiveerde cellen in hydrogeloplossing.
- Crosslinking van hydrogelen met behulp van UVA-licht of dentale lampen.
- Configuratie van microscoopinstellingen voor FRET-imaging.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van cellen ingebed in hydrogels.
- Optimalisatie van de beeldvormingscondities om achtergrondruis te minimaliseren.
- Vaststellen van basissignalen voor FRET-analyse.
- Effectief gebruik van regions of interest voor achtergrondcorrectie.
Conclusies
- De methode verbetert de mogelijkheid om cel signalering in 3D-omgevingen te bestuderen.
- Het biedt een kader voor toekomstig onderzoek in diverse biologische vakgebieden.
- FRET-imaging in hydrogels kan leiden tot vooruitgang in de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
FRET-imaging in driedimensionale hydrogels maakt real-time kwantificering van intracellulaire signalering binnen fysiologisch relevante micro-omgevingen mogelijk, waardoor de beperkingen van traditionele 2D-assays direct worden aangepakt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingstfasen en ondersteunt mechanistische risicoreductie voor drugscreening en de ontwikkeling van biomaterialen. De compatibiliteit van de methode met standaard widefield-microscopie en high-throughput workflows positioneert deze als een schaalbaar middel voor R&D-pijplijnen in het bedrijfsleven.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar intracellulaire signaleringspaden in 3D mogelijk, wat functionele targetvalidatie ondersteunt.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door weefselachtige omgevingen te modelleren voor hypothesetesten.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid door contextafhankelijke cellulaire responsen vast te leggen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde 3D biologische systemen voor op downstream compound screening workflows.
- Ondersteunt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid via ratiometrische FRET-kwantificering.
- Maakt high-throughput imaging en analyse van meerdere cellen over verschillende hydrogeltypen mogelijk.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Lijnt in vitro signaleringsmetingen uit met ziekterelevante 3D-micro-omgevingen.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door weefselspecifieke responsen te modelleren.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door materiaalafhankelijke verschillen in signalering te onthullen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze FRET-beeldmethode integreert processen van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek, waardoor de kloof tussen in vitro-assays en fysiologisch relevante modellen wordt overbrugd.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden in 3D cellulaire contexten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs voor de evaluatie van verbindingen in engineered micro-weefsels.
- Analytiek: Biedt ratiometrische FRET-metingen en achtergrondgecorrigeerde outputs voor een robuuste gegevensvergelijking.
- Translationeel onderzoek: Maakt het mogelijk om in vitro bevindingen af te stemmen op in vivo-achtige weefselreacties.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Aanpasbaar aan diverse hydrogeelsystemen en compatibel met meerdere microscopieplatformen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert imaging- en analyseworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door relevante biologie in een vroeg stadium te modelleren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de voortgang van discoveryprogramma's.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het ontwerp van FRET-probes en kwantitatieve beeldanalyse.
- Toegang tot widefield epifluorescentiemicroscopie en compatibele hulpmiddelen voor de fabricage van hydrogels is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van beeldparameters en workflows voor gegevensverwerking tussen teams.
- Aanpasbaar aan verschillende hydrogelchemieën en celtypen door middel van protocoloptimalisatie.
- De doorvoer en beelddiepte kunnen beperkt worden door de opaciteit van de hydrogel en de configuratie van de microscoop.
