Meten

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de in vitro ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten voor functionele karakterisering. Deze methode kan worden gebruikt om nieuwe vermeende ATPases te karakteriseren, potentiële effectieve activatoren of inhibitoren te evalueren en om de bijdrage van specifieke domeinen of residuen aan de ATPase-activiteit te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, gevoelige methode is voor het meten van de in vitro ATPase-activiteit en gemakkelijk kan worden geoptimaliseerd.

Bereid stocks van alle benodigde reagentia voor incubatie met het gezuiverde eiwit voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng 100 millimol magnesiumchloride en 100 millimol ATP in een verhouding van één op één vlak voordat de ATP-hydrolyse-reactie wordt opgezet. Bereid 1,5 milliliter buisjes voor en label deze voor het verzamelen van monsters met regelmatige intervallen gedurende de reactie.

Bereid buisjes voor om monsters te verzamelen op tijdstip nul en op tijdstippen van 15, 30, 45 en 60 minuten. Voeg 245 µL 1x HNG-buffer toe aan elk buisje om de monsters die uit de ATP-hydrolysereacties zijn verzameld te verdunnen met een verdunningsfactor van 1:50. Bereid vervolgens een bad van droogijs en ethanol voor om de monsters snel te bevriezen en zo de reactie te stoppen.

Voeg in een rubberen ijsemmer of een andere veilige houder enkele stukken droogijs toe en giet voorzichtig voldoende 70% tot 100% ethanol om het droogijs te bedekken. Verdun het gezuiverde eiwit in 1X HNG-buffer en bewaar dit op ijs. Stel de ATP-hydrolysereacties op in de voorbereide 0,5 milliliter buisjes door een vooraf berekend volume water toe te voegen om een eindreactievolume van 30 microliters te bereiken.

Voeg vervolgens zes µL 5X HNG of een andere buffer toe, drie µL van een mengsel van 100 mM magnesiumchloride en ATP, en 0,25 tot vijf µM proteïne. Incubeer een negatieve controleconditie met alleen buffer waarin geen proteïne is toegevoegd. Neem vervolgens op tijdstip nul vijf µL uit de reactie.

Verdun vervolgens het aliquot 1:50 in de voorbereide buis van 1,5 milliliter die 245 microliters HNG-buffer bevat. Vries het monster onmiddellijk in in het bad van droogijs en ethanol. Incubeer de reacties gedurende één uur bij 37 graden Celsius om ATP-hydrolyse mogelijk te maken.

Verwijder bij elk interval aliquots van vijf µL uit de reactie en voeg deze toe aan gelabelde monsterbuisjes met HNG-buffer, zoals eerder beschreven. Verplaats de verdunde monsters aan het einde van de ATP-hydrolysereactie naar een vriezer van 80 °C voor opslag. Wacht ten minste 10 minuten voordat u verdergaat om er zeker van te zijn dat alle monsters volledig bevroren zijn.

Ontdooi de verdunde monsters met ATP-hydrolyse-reactie-aliquots van elk tijdstip bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een 96-wells plaat voor met monsters en fosfaatstandaarden. Verdun in een 0,5 milliliter buis de fosfaatstandaard van 800 micromolar naar 40 micromolar door 5,5 microliters van de standaard toe te voegen aan 104,5 microliters HNG-buffer.

Meng goed en voeg 100 µL van deze 40 µM fosfaatstandaard toe aan well A1 van de 96-well plaat. Voeg 50 µL HNG-buffer toe aan wells B1 tot en met H1 voor seriële verdunningen van de fosfaatstandaard in een verhouding van één op één. Verwijder 50 µL van de 40 µM fosfaat uit well A1, voeg dit toe aan de 50 µL assaybuffer in well B1 en meng.

Verwijder vervolgens 50 µL uit well B1 en voeg dit toe aan well C1, en zet de verdunningen voort tot en met well G1. Verwijder na het mengen 50 µL uit well G1 om ervoor te zorgen dat elke well hetzelfde volume bevat. Well H1 moet alleen buffer bevatten om een fosfaatstandaard van 40 tot nul µM te creëren. Voeg vervolgens van elk monster 50 µL in dubbeltoets toe aan de plaat.

Voeg monsters van hetzelfde tijdstip verticaal in kolommen en monsters van verschillende tijdstippen horizontaal toe. Dit maakt tot acht monsters en vijf tijdstippen per plaat mogelijk. Gebruik een steriele pipette om voldoende malachietgroen meliptaatfosfaat-detectiereagens te verwijderen om 100 microliters aan elke put met monsters en standaarden toe te voegen.

Voeg het detectiereagens toe aan een schaal voor eenvoudig pipetteren met een multichannelpipet. Giet het detectiereagens niet rechtstreeks in de schaal, omdat de kans op fosfaatcontaminatie groot is. Voeg met een multichannelpipet 100 µL van het fosfaatdetectiereagens toe aan elke put en meng dit voorzichtig door een consistent aantal keer op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te introduceren, waarbij wordt gewerkt in volgorde van het laatste tijdspunt naar het eerste tijdspunt.

Laat de plaat 25 minuten op kamertemperatuur staan of volgens de instructies van de fabrikant. Om de resultaten te kwantificeren, wordt de absorbentie van de monsters bij 650 nanometer gemeten met een microplaatlezer voor absorbentie. Representatieve resultaten van kinetische en eindpunt-ATPases worden getoond, waarin de activiteit van wild-type en mutante vormen van de type twee secretie ATPase/EPSE wordt bepaald in aanwezigheid en afwezigheid van het stimulerende cardiolipine.

Hier worden de resultaten van een kinetische door cardiolipine gestimuleerde ATPase getoond, waarin de lineaire fosfaatvrijgave over de tijd wordt aangetoond voor wild-type EPSE en een dubbele lysine-mutant, waarbij bovine serumalbumine dient als negatieve controle. Deze gegevens kunnen worden weergegeven als de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat per minuut gedeeld door de proteïneconcentratie om de ATPase-activiteit van elke proteïne te kwantificeren en te vergelijken. De gegevens geven aan dat twee lysineresten, K417 en K419, bijdragen aan de door cardiolipine gestimuleerde ATPase-activiteit van EPSE.

Een vergelijking van de ATPase-activiteit van dezelfde eiwitten zonder cardiolipine-stimulatie laat zien dat deze twee lysine-residuen niet bijdragen aan de lage basale activiteit van EPSE, maar juist aan het vermogen van het eiwit om door cardiolipine te worden gestimuleerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de ATPase-activiteit van gezuiverde eiwitten snel en nauwkeurig kunt kwantificeren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de gevoeligheid van het fosfaatdetectiereagens.

Om fosfaatcontaminatie te voorkomen, raden wij het gebruik van wegwerpplastics en ultrapuur water aan, en het uitvoeren van grootte-uitsluitings- of ionenuitwisselingschromatografie na de eiwitzuivering.