Observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus
25 december 2016
Een protocol voor het onderzoeken van het paringsgedrag van de dennennematode, Bursaphelenchus xylophilus, wordt gepresenteerd. Gedragskenmerken van B. xylophilus worden beschreven in het paringsproces.
Het algemene doel van deze procedure is om het paringsgedrag van de dennehoutworm, Bursaphelenchus xylophilus, te observeren. Deze methode kan helpen bij het bevorderen van psychologische studies van de worm. Het gaat specifiek over het observeren van het paringsgedrag van de dennehoutworm.
Het grote voordeel van deze techniek is dat ongeslachtelijke volwassenen kunnen worden verkregen, wat het veel gemakkelijker maakt om het paringsgedrag van volwassenen te observeren. De implicaties van deze techniek zijn puur gericht op de bredere studie van nematoden, omdat ze vergelijkbare levenscyclusgedragingen hebben. De demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het verkrijgen van ongeslachtelijke volwassen nematoden moeilijk is omdat de beperkingen van ontwikkelende nematoden oefening vereisen en het niet gemakkelijk is om mannetjes en vrouwtjes in de vroege eerste stadium-jongens nauwkeurig te onderscheiden.
Om dennehoutwormen te kweken, bereidt u eerst aardappel-dextrose-agarplaten voor. Om een plaat te inoculeren, prikt u een stuk schimmelmat met een diameter van 10 millimeter van een betritus senaria-mat, en plaatst u deze in het midden van een nieuwe PDA-plaat. Cultiveer de schimmelmat gedurende vijf dagen bij 25 graden Celsius in het donker.
Na vijf dagen voegt u de dennehoutwormen toe aan de voorbereide petrischaal en kwekt u ze gedurende drie dagen bij 25 graden Celsius in het donker. Om de wormen van de schimmel te isoleren, bereidt u eerst een verzamelgereedschap. Plaats een geklemde rubberen buis onder een trechter, en houd de voorbereide trechter in een rek om de baermann-trechterinrichting te monteren.
Plaats vervolgens twee lagen filterpapier in de mond van de trechter in plaats van gaas. Breng nu de schimmelculturen over naar de trechteropstelling en voeg water toe totdat de schimmelmat is ondergedompeld. Na twee uur komen de wormen uit de schimmelcultuur, steken het filterpapier over en nestelen zich in het laagste deel van de baermann-trechter.
Verzamel de wormen door een 15 milliliterbuis onder de trechter te plaatsen, en laat vervolgens langzaam de klemming los om een paar druppels water te verzamelen, die de wormen zullen bevatten. Centrifugeer de wormverzamelingen bij 3.000 G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het bovenste waterniveau en suspendeer de wormen opnieuw in één milliliter water.
Breng de wormensuspensie over naar een glazen schaal van zes centimeter en voeg drie milliliter water toe om de wormen vrij te laten zwemmen. Verzamel nu eieren om ongeslachtelijke voorraden te maken. Breng de schaal over naar een donkere incubator en laat de zwangere vrouwtjes eieren leggen gedurende 10 minuten.
Vanwege hun glycoproteïne-oppervlak zullen de eieren aan het glas blijven kleven. Verwijder vervolgens het water met de wormen voorzichtig om de aan het schaaltje vastzittende eieren niet te verstoren. Voeg dan snel 3 milliliter water terug toe aan het schaaltje om te voorkomen dat de eieren uitdrogen.
Herhaal dit proces van het schoonmaken van eieren minstens drie keer om alle larven en volwassenen te verwijderen en zuivere eieren te verkrijgen. Voeg vijf milliliter water toe aan de gewassen zuivere eicollectie en ga verder met het ontwikkelen van de eieren in het donker bij 25 graden Celsius. 24 uur na het starten van de eicultuur, verzamelt u de uitgekomen J2-larven.
Breng de J2-larven voorzichtig over in een 15 milliliterbuis. Centrifugeer vervolgens de collectie bij 3.000 G gedurende twee minuten. Verwijder het bovenste waterniveau en voeg 200 microliters water terug toe.
Vervolgens kweekt u de J2-larven op een PDA-plaat voorbereid met een mat van schimmel. Na 52 uur zullen de meeste J2-larven zich hebben ontwikkeld tot vroege J4-larven. Monteer een baermann-trechter en trek de wormen gedurende twee uur uit de schimmelculturen, zoals eerder beschreven.
Terwijl u wacht, bereidt u een naald voor om de wormen op te pakken. Trek een punt van een glazen capillair verwarmd over een alcoholbrander. De punt moet ongeveer 50 micron in diameter zijn, ongeveer de lichaamsbreedte van een volwassen worm.
Na twee uur brengt u de J4-larven over in een schone petrischaal zoals eerder beschreven. Bepaal nu het geslacht van de wormen onder een stereomicroscoop. Ongeveer tweederde van de larven zijn meestal vrouwelijk.
De vulva van de vrouwtjes is duidelijk anders dan de anatomie van de mannetjes, maar omdat de wormen erg actief zijn, zal geslachtsonderscheiding oefening vergen. De meest cruciale stap in dit protocol is om mannetjes en vrouwtjes nauwkeurig te onderscheiden en te scheiden in het vroege eerste stadium. Anders zullen er gemengde en slechte wormen zijn wanneer ze volwassen worden.
En dat maakt het moeilijk om de paring te observeren. Selecteer en breng de wormen geleidelijk over naar een druppel water op een schuif voor mannetjes of vrouwtjes. Om succes te garanderen, moeten twee verschillende personen de geslachtsverdeling dubbel controleren.
Breng nu de waterdruppel met de geslachtsverdeelde wormen over naar een geschikte schimmelcultuurplaat. Kweek vervolgens de ongeslachtelijke wormen nog eens 24 uur voordat u hun paringsgedrag bestudeert. Om het paringsgedrag van dennehoutwormen te observeren, bereidt u eerst verschillende holle schuiven voor door 200 microliters water toe te voegen aan elk van hun putjes.
Kies vervolgens een enkele voorbereide ongeslachtelijke volwassene en breng deze over naar een voorbereide schuif. Houd de ongeslachtelijke volwassenen een uur binnen in de put om ze te laten wennen aan de nieuwe waterige omgeving. Voeg na een uur een enkele ongeslachtelijke volwassene van het andere geslacht toe aan de put, met behulp van een pipet.
Observeer vervolgens het paringsgedrag onder een stereomicroscoop en film het gedrag voor kwantitatieve analyse. Het hele paringsproces is meestal binnen twee uur voltooid. Elke 30 minuten voegt u
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het observeren van het paringsgedrag van de dennen nematode, Bursaphelenchus xylophilus. De methode richt zich op het verkrijgen van maagdelijke volwassenen om de bestudering van paringsgedrag te faciliteren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Nematologie
Achtergrond
- Bursaphelenchus xylophilus is een belangrijke nematode-soort.
- Inzicht in het paringsgedrag kan informatie verschaft over de levenscycli van nematoden.
- Het verkrijgen van maagdelijke volwassenen is essentieel voor nauwkeurige observaties.
- Het onderscheid maken tussen mannelijke en vrouwelijke nematoden kan uitdagend zijn.
Doel van de studie
- Om het paringsgedrag van Bursaphelenchus xylophilus te observeren.
- Om psychologische studies met betrekking tot nematoden verder te ontwikkelen.
- Om technieken te ontwikkelen voor een eenvoudigere observatie van paringsgedragingen.
Gebruikte methoden
- Protocol voor het verkrijgen van maagdelijke volwassen nematoden.
- Observatie van paringsgedrag onder gecontroleerde omstandigheden.
- Identificatie van mannelijke en vrouwelijke nematoden.
- Documentatie van gedragskenmerken tijdens de paring.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle acquisitie van maagdelijke volwassenen voor observatie.
- Gedetailleerde beschrijvingen van geregistreerde paringsgedragingen.
- Inzichten in de uitdagingen bij het identificeren van het geslacht van nematoden.
- Implicaties voor bredere studies naar het gedrag van nematoden.
Conclusies
- Het protocol vergroot het begrip van het paringsgedrag van nematoden.
- Het biedt een basis voor toekomstig onderzoek in de nematologie.
- Uitdagingen bij het verkrijgen en identificeren van nematoden worden aangepakt.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Kwantitatieve observatie van het paringsgedrag bij Bursaphelenchus xylophilus maakt nauwkeurige gedragsfenotypering mogelijk, wat essentieel is voor vroege ontdekking en targetvalidatie in nematodenonderzoek. Gestandaardiseerde verkrijging van maagdelijke volwassenen en reproduceerbare gedragsmetrieken ondersteunen mechanistische risicoreductie en vergelijkende studies tussen nematodensoorten. Dit protocol versterkt het voorspellende vertrouwen voor translationeel onderzoek en portfolio-triage in parasitologie en ethologie-gestuurde pijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt rigoureuze toetsing van gedragshypothesen mogelijk door gecontroleerde observatie van paringsfasen en subgedragingen.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het isoleren van maagdelijke volwassenen en het kwantificeren van de succespercentages van de paring.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door onderscheid te maken tussen intra- en interseksuele competitiedynamiek.
- Biedt reproduceerbare gedragseindpunten voor comparatieve nematode-studies.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde gedragstests vast met behulp van gesynchroniseerde en gesexeerde nematodepopulaties.
- Levert kwantitatieve resultaten, zoals phaseduren en paringsfrequenties, voor de standaardisatie van de assay.
- Maakt reproduceerbaarheid en schaalbaarheid mogelijk in platforms voor gedragsscreening.
- Bereidt robuuste systemen voor op downstream-studies naar verbindingen of genetische interventies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt gedragsfenotypering uit met de translationele ontwikkeling van biomarkers in nematodenmodellen.
- Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door cross-species gedragsvergelijkingen mogelijk te maken.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve gedragsgegevens.
- Biedt mechanistische inzichten die relevant zijn voor ziekte-gerelateerde nematodensystemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor gedragskwantificering is geïntegreerd in het vroege continuüm van discovery naar preklinisch onderzoek en ondersteunt hypotheseonderzoek, assayontwikkeling en translationeel onderzoek in de biologie van nematoden.
- Discovery Biology: Faciliteert het testen van nulhypothesen en de verduidelijking van pathways via gecontroleerde gedragsobservatie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare gedragsassays op met kwantitatieve output voor screening sẵnheid.
- Analytics: Biedt meetbare eindpunten, zoals faseduur en paringssuccespercentages, voor statistische vergelijking.
- Translationeel onderzoek: Maakt het mogelijk om gedragstypische fenotypes af te stemmen op preklinische en ziekterelateerde modellen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Biedt een herbruikbaar protocol dat aanpasbaar is voor andere nematode-soorten en ethologische studies.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in gedragsstudies.
- Operationele waarde: Standardiseert gedragsassays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over onderzoeksteams heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door robuuste gedragseindpunten te bieden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de voortgang van onderzoeksprogramma's naar nematoden.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in het kweken, bepalen van het geslacht en het observeren van het gedrag van nematoden onder een stereomicroscoop.
- Toegang tot gesynchroniseerde kweeksystemen, videoregistratie en kwantitatieve analyse-instrumenten is noodzakelijk.
- Strenge standaardisatie tussen teams is vereist voor de geslachtstoewijzing en de score van het gedrag.
- Aanpasbaar voor andere nematodensoorten met vergelijkbare levenscycli en gedragskenmerken.
- Precisie bij het bepalen van het geslacht en de hantering is essentieel om gemengde populaties te vermijden en geldige resultaten te garanderen.
