Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult Drosophila Brains

Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige dissectieprocedure in één stap te beschrijven voor volwassen Drosophila-hersenen, die snel hersenen kan produceren met goed bewaarde morfologie geschikt voor gehele berginganalyse. Deze methode kan helpen vragen te beantwoorden op het gebied van neurowetenschappen en genetica. Dit omvat fijne mapping van hersencircuits, het bestuderen van de effecten van genetische manipulaties van neuronen en functionele karakterisering van genen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudig te leren procedure betreft. Het kan helpen bij het uitnemen van een volwassen vlieg hersenen met goed bewaarde morfologie in minder dan 10 seconden. Videodemonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het controleren van de vereiste momentum bij het loslaten van de forceps om het exoskelet rond het vliegkop af te scheuren, vaardigheden en oefening vereist.

Deze kleine, vervelende fruitvliegen hebben ons veel geleerd over de biologische principes. Ze kunnen ons ook helpen de oorzaken en de geneesmiddelen voor menselijke ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson, te vinden. Gebruik een dissectiesmicroscoop ingesteld op 1,2 X vergroting, immobiliseer een verdoofde vlieg en dompel hem onder in koude dissectieoplossing met de buik naar boven.

Houd de forceps op een hoek van 160 tot 170 graden ten opzichte van de dissectieplaat, en oefen vervolgens een kleine kracht uit op de buik van de vlieg. Dit zou de vlieg moeten immobiliseren, het hoofd 15 tot 25 graden naar achteren dwingen en de proboscis omhoog uitstrekken. Na deze manoeuvre zou een zachte, doorschijnende regio van de cuticula onder de proboscis duidelijk moeten worden.

Verhoog de vergroting en pas het brandpunt aan op deze regio. Gebruik de dominante hand, neem een paar dissectieforceps en oefen druk uit om de punten te sluiten. Plaats de forceps loodrecht op de forceps die de vlieg vasthoudt.

Priem de gesloten punten van de forceps door de zachte doorschijnende regio van de cuticula, zorg ervoor dat ze niet zo diep doordringen dat ze de hersenen raken. Laat vervolgens snel, maar gestaag, de forceps los, zodat de punten openen en het exoskelet van het vliegkop afscheuren. Gebruik het momentum van het loslaten van de forceps punten om het exoskelet en het grootste deel van de kopkast, geassocieerd met oog en trachea, in één beweging voorzichtig uit het hersenweefsel te verwijderen.

Een intacte hersenen moet nu zichtbaar zijn. Gebruik de forceps om voorzichtig de resterende accessoireweefsels te verwijderen, zoals het witte fibreuze tracheale weefsel, zorg ervoor dat u niet aan de hersenen trekt of deze beschadigt. Plaats de gedissekteerde hersenmonsters met bijbehorende rompen in ongeveer één milliliter 4% paraformaldehyde op ijs gedurende 40 tot 60 minuten.

Verwijder de paraformaldehyde en spoel vervolgens de monsters met één milliliter één X PBS door de oplossing drie keer op en neer te pipetten, zorg ervoor dat u de hersenen niet aanzuigt. Verwijder vervolgens de PBS en was vervolgens vijf keer met één milliliter één X PBT gedurende vijf minuten elk met nutatie. Voeg het primaire antilichaam van belang toe bij de juiste verdunning.

En incubeer vervolgens de monsters een nacht bij vier graden Celsius met nutatie. Verwijder het primaire antilichaam en was de monsters vijf keer met één milliliter één X PBT gedurende vijf tot tien minuten elke wassing met nutatie. Voeg secundair antilichaam toe aan de gewassen monsters bij de juiste verdunning en incubatietijd.

Was vervolgens de monsters zes keer in één milliliter één X PBT gedurende tien minuten elk met nutatie. Deze stap is cruciaal om alle niet-specifiek gebonden secundaire antilichamen te verwijderen. Incubeer de monsters in een een tot 10.000 verdunning van één milligram per milliliter DAPI in één milliliter één X PBT oplossing gedurende 30 tot 60 minuten met nutatie.

Spoel ten slotte de monsters door één milliliter één X PBS toe te voegen en pipet de oplossing vervolgens drie keer op en neer. Plaats een dekglas op een montageslide. Gebruik een pipet met een gesneden punt om de hersenen in één X PBS oplossing op het dekglas over te brengen.

Gebruik vervolgens forceps om de hersenen van de lichamen te scheiden. Gebruik een fijne pipetpunt om de vloeistof rond het hersenweefsel te verwijderen. Voeg vervolgens 20 tot 40 microliters anti-fade montagemedium toe.

Verspreid voorzichtig de hersenen, terwijl u het viskeuze medium naar buiten verplaatst. Begin aan één kant en laat voorzichtig een tweede dekglas op de monsters zakken, zorg ervoor dat u contact van de hersenen met bubbels minimaliseert. Laat de slips bezinken en verwijder vervolgens overtollig vocht van de rand van de slips met een laboratoriumdoekje.

Gebruik een klein stukje tape om het dekglaspaar tijdelijk aan de montageslide te hechten. Gebruik een samengestelde fluorescente of confocale microscoop om de monsters af te beelden. Deze afbeeldingen tonen voorste en achterste uitzichten van dezelfde volwassen Drosophila.

Celkernen werden gevisualiseerd door DAPI-kleuring en neuronen werden gelabeld met behulp van een pan neuronaal marker en anti-ELAV antilichamen. Dopaminerge, of DA, neuronen werden onthuld door anti-TH antilichaamkleuring. Vergelijkbare intensiteitsniveaus werden gezien tussen beide zijden van de hersenen voor alle beeldkanalen.

Uitgebreidere weergaven van de voorkant en de achterkant van de hersenen maken een gedetailleerde onderzoek mogelijk van de DA neuronale clusters. De gepaarde voorste mediale cluster kan worden gezien in de voorste beelden, en de gepaarde achterste mediale en gepaarde achterste laterale clusters aan de achterste kant van de hersenen. Kwantificering van deze neuronen toonde aan dat drie dagen oude mannelijke w1118 stamvliegen doorgaans 27 DA neuronen in de PPM-cluster in de hele hersenen hebben, 16 in de PPL-cluster per hemisfeer en vijf in de PAL-cluster per hemisfeer.

Een gemiddelde van 97 DA neuronen werd gezien in elk van de PAM-clusters. 3D reconstructie van de PAL en PAM clusters toonde ook dat de