Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes
22 mei 2017
Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.
Het algemene doel van deze beeldanalyse is om de mobiliteit van blaasjes in neuronen te observeren en deze eenvoudig te kwantificeren. Deze benadering maakt het mogelijk om membraantransport in neuronen op een ongecompliceerde en tijdefficiënte manier te analyseren. Om met deze procedure te beginnen, brengt u de baarmoeder over naar een nieuwe Petrischaal met 70% ethanol.
Breng vervolgens de baarmoeder over naar een andere Petrischaal met HBSS. Verwijder daarna de foetussen uit de baarmoeder met steriele dissectiepincetten en een chirurgische schaar. Plaats ze vervolgens in een nieuwe Petrischaal met HBSS.
Verwijder onder een stereomicroscoop de huid en de schedels en neem de hersenen uit met gesteriliseerde dissectiepincetten. Breng deze vervolgens over naar een andere Petrischaal met HBSS. Verwijder de hersenvliezen met gesteriliseerde dissectiepincetten.
Trim vervolgens de overtollige regio's weg. Breng daarna de cortices over naar een nieuwe Petrischaal met HBSS. Verzamel alle cortices met een wegwerppipet of een pipette van 25 milliliter en plaats ze in een buis van 15 milliliter.
Verwijder daarna de HBSS met een pipet. Voeg vervolgens drie milliliter cerebrale corticale enzymoplossing toe aan de buis met de cortices. Plaats de buis in een waterbad en incubeer deze vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Voeg daarna nog eens drie milliliter cerebrale corticale enzymoplossing toe aan de buis met de cortices en incubeer deze gedurende nog eens vijf minuten in een waterbad bij 37 °C. Verwijder na vijf minuten de cerebrale corticale enzymoplossing en voeg vijf milliliter DMEM toe waarin 10% foetaal runderserum is opgelost. Dissocieer de cortices door voorzichtig op en neer te pipetteren met een vijf milliliter pipet voorzien van een steriele P1000-tip.
Pipette vervolgens de cortices opnieuw met een pipette van 5 ml voorzien van een P200-tip. Plaats een nylon cell strainer van 40 µm op een buis van 50 ml en filter de suspensie om het debris te verwijderen. Centrifugeer de suspensie vervolgens 5 minuten bij 420 ×g op kamertemperatuur en verwijder daarna het DMEM-medium.
Voeg vervolgens vijf milliliters cerebraal corticaal kweekmedium toe en resuspendeer het celpellet voorzichtig. Tel daarna de cellen met een hemocytometer en stel de celconcentratie bij met behulp van het cerebraal corticaal kweekmedium. Zaai vervolgens drie keer 10^6 corticale neuronen in twee milliliters celsuspensie uit in elke gecodeerde glazen bodemschaal van 35 milliliter.
Meng in deze procedure vier µg plasmide met 200 µL serumvrij medium. Verdun in een aparte buis acht µL van het transfectiereagens in 200 µL serumvrij medium. Incubeer de oplossing vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Meng na vijf minuten de plasmidoplossing en de transfectie-reagensoplossing en laat het mengsel 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg het mengsel vervolgens toe aan de gecoate glazen bodemschalen. Incubeer de neuronen 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Vervang vervolgens het medium door twee milliliters cerebraal corticaal cultuurmedium en incubeer de neuronen gedurende één tot twee dagen bij 37 °C. Gebruik voor beeldvorming een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera en 40X objectieven. Houd de temperatuur op 37 °C met behulp van een incubatiesysteem.
Leg neuronbeelden vast met één frame om de vijf seconden over een periode van 100 seconden, aangestuurd door de software voor beeldacquisitie. Open alle opeenvolgende beelden in de ImageJ-software met Manual Tracking om de beelden te analyseren. Om de opeenvolgende beelden te combineren, selecteert u Image, vervolgens Stacks, gevolgd door Images to Stack en klikt u daarna op OK. Kies daarna Plugins en vervolgens Manual Tracking.
Er verschijnt een Tracking-venster. Selecteer het selectievakje Toon parameters en definieer de trackingparameters in het gedeelte Parameters. Klik vervolgens op Voeg track toe om een nieuwe track te starten.
Nadat de relevante blaasjes zijn bepaald, klikt u op het centrum van de signalen in de sequentiële beelden om de xy-coördinaten vast te leggen. Herhaal deze procedure om de xy-coördinaten van de blaasjes uit alle sequentiële beelden te verzamelen; elk beeld gaat automatisch over naar het volgende beeld nadat het referentiepunt is geselecteerd. Dit beeld toont de motiliteit van LAMP-EGFP-bevattende blaasjes in de dendrieten van corticale neuronen van muizen na twee dagen transfectie, gestart op vier DIV.
De inzet toont het time-lapse beeld van de LAMP-EGFP positieve blaasjes. De rode pijlpunt geeft een bewegend blaasje aan en de blauwe pijlpunt geeft een rustend blaasje aan. De oranje pijlpunten geven sterkere fluorescentiesignalen aan.
Hier is de tijdsafhankelijke X-as positie van de LAMP-EGFP positieve blaasjes. Het blaasje in de rode cirkel, aangeduid met b, beweegt en het blaasje in de blauwe cirkel, aangeduid met a, is in rust. Dit staafdiagram geeft de totale afstand van de LAMP-EGFP beweging aan.
En deze staafgrafiek geeft de gemiddelde motiliteitsafstand aan van vesicles die LAMP-EGFP bevatten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen, wat essentieel is voor het begrijpen van neuronale functies. De aanpak maakt een eenvoudige analyse van membraantransport in het zenuwstelsel mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Membraantransport
Achtergrond
- Membraantransport is van cruciaal belang voor de neuronale functie.
- Vesikelmobiliteit speelt een sleutelrol in dit proces.
- Inzicht in deze mechanismen kan leiden tot nieuwe inzichten in de gezondheid van neuronen.
- Huidige methoden voor het kwantificeren van vesikelbeweging zijn vaak complex.
Doel van de studie
- Om een handige methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van de vesikelmotiliteit.
- Om de analyse van membraantransport in neuronen te faciliteren.
- Om het begrip van neuronale functies te verbeteren door middel van verbeterde methodologieën.
Gebruikte methoden
- Beeldanalyse om de mobiliteit van blaasjes te observeren.
- Overdracht van biologische monsters naar geschikte media voor analyse.
- Gebruik van gesteriliseerde instrumenten voor de monsterbehandeling.
- Tijdsefficiënte procedures voor kwantificatie.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een eenvoudige kwantificering van de vesikelmotiliteit mogelijk.
- Het biedt een directe aanpak voor het analyseren van membraantransport.
- De resultaten kunnen bijdragen aan een beter begrip van neuronale functies.
- Potentiële toepassingen in diverse onderzoeksterreinen binnen de neurowetenschappen.
Conclusies
- Deze methode vereenvoudigt de studie naar vesikelmotiliteit in neuronen.
- Het kan worden aangepast voor diverse toepassingen binnen de neurowetenschappen.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze benadering om de neuronale gezondheid te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het kwantificeren van de vesikelmobiliteit biedt cruciale inzichten in de mechanismen van membraantransport die de neuronale gezondheid en ziektefenotypes beïnvloeden. Deze methode maakt validatie van targets in een vroeg stadium mogelijk door subcellulaire dynamiek te koppelen aan functionele uitkomsten in neurodegeneratieve modellen. De aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij preklinische screening door kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van vesiculair transport te leveren in ziekterelevante neuronale systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de motiliteit van endosomen en lysosomen te meten als functionele uitkomatmaten voor de neuronale gezondheid.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door gestandaardiseerde kwantificering van vesikelbeweging in ziekterelevante cellulaire modellen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door motiliteitsdefecten te correleren met mechanistische pathways bij neuronale aandoeningen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve metingen van de beweeglijkheidsafstand en -snelheid voor compound-screening in neurieten en soma.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay via ImageJ-gebaseerde tracking met gedefinieerde parameters en time-lapse-beeldvorming.
- Schaalbaarheid: Compatibel met meerdere celtypen, waaronder fibroblasten en endotheelcellen, wat hergebruik over verschillende platforms mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door vesikel-dynamiek te koppelen aan neuronale overleving en synaptische functie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door consistente motility-metingen over verschillende modellen heen.
- Risicobeperking: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door verbindingen te identificeren die transportdefecten herstellen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door kwantitatieve mobiliteitsgegevens te leveren die inzicht geven in target engagement en padmodulatie in neuronale systemen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door de beweging van blaasjes te kwantificeren als een functionele readout voor de integriteit van membraantransport.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde imaging- en trackingprotocollen voor tijdgevoelige analyse van blaasjes.
- Analytiek: Genereert metrieken voor mobiliteitsafstand en gemiddelde beweging die vergelijkende analyse tussen experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door defecten in het vesiculair transport te koppelen aan mechanismen van neurodegeneratieve ziekten.
- Herbruikbaarheid in de praktijk: Fungeert als een herbruikbaar imagingplatform dat toepasbaar is op diverse neuronale en niet-neuronale cellijnen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door ambiguïteit in mechanistische verbanden tussen transportdefecten en neuronale fenotypes te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van plug-in-gebaseerde analyse en gedefinieerde trackingparameters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door objectieve, kwantitatieve gegevens te verschaffen over target engagement in vesikelmotiliteitsroutes.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door verbindingen te identificeren die de endosoom-lysosoomdynamiek in ziektemodellen moduleren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neuronale culturen, transfectie en fluorescentiemicroscopie voor nauwkeurige labeling en imaging van blaasjes.
- Afhankelijk van het ImageJ-platform met de Manual Tracking-plug-in en mogelijkheden voor sequentiële beeldverwerking.
- Maakt standaardisatie van de transfectie-efficiëntie, imaging-intervallen en tracking-parameters over verschillende experimenten heen noodzakelijk.
- Aanpassing aan verschillende cellijnen kan optimalisatie van de markerexpressie en basismetingen van de motiliteit vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de transfectie-efficiëntie en potentiële fototoxiciteit tijdens langdurige time-lapse imaging.
