Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert

Het algemene doel van dit experiment is het bepalen van de 5-Methylcytosine-niveaus tijdens de dedifferentiatie van chondrocyten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen bij celgebaseerde behandelingen van kraakbeendefecten, zoals autologe chondrocytenimplantatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een betrouwbare, eenvoudige en snelle methode is voor het detecteren van het algemene DNA-methylatieniveau om het fenotype van de chondrocyten te evalueren.

De implicatie van deze technologie is van standaardbelang voor ons aandeel in autologe chondrocytenimplantatie, omdat DNA-methylering tijdens de dedifferentiatie van chondrocyten een groot obstakel vormt voor de behandeling van kraakbeendefecten via autologe chondrocytenimplantatie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de DNA-methyleringsniveaus bij de dedifferentiatie van chondrocyten, kan zij ook worden toegepast op andere ziektestudies, zoals artrose. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we de protocollen in de referenties van een dot blot-methode lazen.

Het is essentieel om een demonstratie van deze methode te tonen, aangezien de staten van een dot blot moeilijk te benoemen zijn. Genomisch DNA moet worden gedenatureerd en vervolgens serieel worden verdund. Daarna moet het worden gefixeerd op een positief geladen nylonmembraan.

Zhaofeng Jia, een promovendus uit ons laboratorium, zal de procedures demonstreren. De gewrichtskraakbeenweefsels die in deze studie zijn gebruikt, werden geïsoleerd uit de kniegewrichten van donorpatiënten na een trauma. Snijd het kraakbeen met een steriel scalpel in blokjes van één tot twee kubieke millimeter.

Voeg vervolgens 1 mg/mL collagenase II en DMEM toe aan het fijngehakte kraakbeen. Incubeer dit gedurende 12 tot 16 uur bij 37 °C om de chondrocyten te verteren. Filter de resulterende cel-suspensie de volgende dag door een cell strainer van 40 µm.

Centrifugeer de cellen. Verwijder het supernatant, voeg PBS toe en centrifugeer opnieuw. Tel de cellen met een hemocytometer.

Zaai de cellen uit met een dichtheid van 20 000 tot 30 000 cellen per vierkante centimeter in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Kweek deze in een incubator bij 37 °C gedurende 48 uur. Oogst de subconfluente cellen met behulp van 0,25% trypsine-EDTA.

En zaai opnieuw uit bij een dichtheid van 6.600 cellen per vierkante centimeter. Kweek de chondrocyten in monolayers gedurende maximaal zes passages en voer beoordelingen uit bij passage één, twee, drie, vier en vijf. Om deze procedure te starten, worden de cellen verzameld door trypsinisatie en centrifugatie.

Resuspendeer de cellen vervolgens in 500 µL lysisbuffer per 10 miljoen cellen door middel van pipetteren en snel omkeren. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Voeg proteinase K toe in een concentratie van 160 µg/mL cellysaat en schud het mengsel krachtig door middel van inversie.

Incubeer zes uur lang bij 55 °C. Voeg aan elk monster één volume Tris pH 7.9 verzadigd fenol met chloroform en isoamylalcohol toe. Schud het monster grondig met de hand gedurende ongeveer 20 seconden.

Centrifugeer de monsters bij kamertemperatuur bij 13 000 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder de bovenste waterige fase en breng deze over naar een nieuwe buis. Voeg aan elke buis een gelijk volume chloroform toe om het fenol te verwijderen.

Schud handmatig en centrifugeer kort. Draag de bovenste waterige fase over naar een nieuw buisje. Voeg 0,1 samplevolume van drie molar natriumacetaat pH 8 en twee volumes 100% ethanol toe.

Bewaar de buisjes een nacht bij -20 °C om het genomisch DNA te laten neerslaan. Centrifugeer de monsters de volgende dag bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 16.000 ×g om het genomisch DNA te pelletteren. Was de monsters met 70% ethanol.

Centrifuge vervolgens bij 4 °C gedurende twee minuten bij 13.000 ×g. Verwijder voorzichtig het supernatant en laat het DNA-pellet aan de lucht drogen. Resuspendeer het DNA in 10 mM tris pH 8,0 0,1 mM EDTA. Begin deze procedure door het geïsoleerde DNA gedurende 10 minuten bij 95 °C te denatureren in 0,1 M natriumhydroxide.

Neutraliseer het DNA met één molair ammoniumacetaat op ijs. Verdun het vervolgens tweevoudig met dubbel gedestilleerd water. De meest kritische stap in de dot blot-assays is het spotten van de monsters; doe dit langzaam en zorgvuldig.

Probeer elk gespotte array te beperken tot een diameter van drie tot vier millimeter. Breng met een pipetpunt met een smalle opening voorzichtig twee µL van het serieel verdunde genomische DNA aan in het midden van het raster op een positief geladen nylon membraan. Blot het membraan gedurende 30 minuten bij 80 °C.

Blok vervolgens de niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen door het membraan één uur lang bij kamertemperatuur onder zachte schudding in een petrischaal van 10 centimeter te laten weken in 5% BSA in TBST. Was het membraan na één uur drie keer gedurende vijf minuten in TBST. Incubeer het membraan vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius in TBST met een muismonoklonaal antilichaam tegen 5-methylcytosine.

Was de volgende dag het membraan drie keer gedurende vijf minuten per keer in TBST. Incubeer het membraan vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur met een secundair antilichaam, mierikswortelperoxidase-geconjugeerd schapen anti-muis immunoglobuline G in TBST. Nadat het membraan zoals eerder beschreven in TBST is gewassen, wordt het enzymsubstraat aan het membraan toegevoegd en vindt er een incubatie plaats van vijf tot 10 minuten.

Visualise ten slotte het signaal van het secundaire antilichaam met behulp van een chemiluminescentiekit volgens de instructies van de fabrikant. Chondrocyten die in een monocultuur werden gekweekt tot passage zes vertoonden progressieve fenotypische veranderingen, waarbij ze bij opeenvolgende passages steeds meer ingesnoerd en afgeplat raakten. Deze morfologische verandering is typerend voor het proces van chondrocyten-dedifferentiatie.

Genomisch DNA werd geïsoleerd uit chondrocyten na een variërend aantal passages en de DNA-methyleringsniveaus werden beoordeeld met een 5-Methylcytosine-specifieke dot blot-assay. De intensiteiten van de dots werden vervolgens geanalyseerd met Image J. Er werden progressief verhoogde niveaus van 5-methylcytosine waargenomen bij langdurige subcultuur, wat wijst op een verband tussen algemeen verhoogde methyleringsniveaus en dedifferentiatie van chondrocyten. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 24 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de concentratie en zuiverheid van het genomisch DNA te maximaliseren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals genomische DNA-methyleringsprofilering, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de dedifferentiatie van chondrocyten in monocultuur. Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van autologe chondrocytenimplantatie in staat gesteld om de DNA-methylering van chondrocyten te evalueren en het chondrocytenfenotype bij de behandeling van kraakbeendefecten te bepalen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de 5-Methylcytosine dot blot gebruikt om degeneratieve machinatiewerkzaamheden van de lever te detecteren om het chondrocytfenotype te evalueren. Vergeet niet dat werken met fenol extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd handschoenen gedragen moeten worden tijdens het uitvoeren van deze procedure.