Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus
7 augustus 2017
Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.
Het algemene doel van deze methode voor het bemonsteren van mucosale bekledingsvloeistof is om de lokale immuunsignaturen van de luchtwegen te bestuderen zonder de noodzaak van stimulatieprocedures. Deze methode stelt u in staat om belangrijke vragen te bestuderen op het gebied van pediatrische aandoeningen van de luchtwegen, zoals infecties, astma en allergie. De voordelen van de methode zijn dat u zeer lage niveaus van immuunmediatoren in de niet-gestimuleerde luchtwegmucosa in vivo kunt meten.
De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Wolsk. Voor het verzamelen van monsters bij pasgeborenen, snijdt u eerst minstens twee stroken van drie bij 15 millimeter van vezelige gehydroxyleerde polyester filtervellen. Plaats vervolgens de pasgeborene op een bed en noteer eventuele symptomen van luchtweginfectie.
Gebruik vervolgens een pincet om één stuk filterpapier ongeveer één centimeter in de voorste delen van de inferieure turbinaat van elke neusholte van de baby te steken en geef de pasgeborene naar behoefte suikerwater voor comfort. Let op eventueel niezen, aanhoudend huilen of epistaxis dat optreedt tijdens de bemonsteringsperiode. Na twee minuten absorptie, brengt u de filterpapieren over in een gelabelde buis voor onmiddellijke opslag bij min 80 graden Celsius.
De experimentele procedure wordt gedemonstreerd door Lisbeth Rosholm, een technicus in mijn laboratorium. Voor de kwantificering van immuunmediatoren in de luchtwegen, plaatst u maximaal 10 monsters uit de opslag bij min 80 graden Celsius op ijs en noteert u hun identificatienummers. Wanneer de monsters zijn ontdooid, dompelt u beide filterpapieren per proefpersoon in 150 microliter vers bereide buffer per filterpapier, aangevuld met één complete proteaseremmertablet per 25 milliliter buffervoorraadoplossing.
Breng de monsters over naar een plate shaker op 400 tpm gedurende vijf minuten. Breng de buffer en filterpapieren over in de cups van individuele celluloseacetaatbuisfilters. Centrifugeer de monsters om het gefilterde nasale extract aan de bodem van de microcentrifugebuisjes te verzamelen.
Verwijder vervolgens de cups en plaats de buisjes op ijs. Breng vervolgens 150 microliter aliquots van het nasale extract over in individuele wells van opslagplaten met lage eiwitbinding en bewaar de platen bij min 80 graden Celsius tot analyse. Meet vervolgens de concentratie van de nasale immuunmediatoren van belang door een zeer gevoelige elektrochemiluminescentie-gebaseerde multiplexed array volgens standaard assay protocollen.
In deze representatieve analyse van 620 pasgeborenen, vertoonde de meeste gemeten immuunmediatoren een laag detectieniveau. IFN gamma-niveaus waren onder de onderste detectielimiet in bijna de helft van de monsters, terwijl TNF alfa, CCL4 en TGF beta-niveaus onder de onderste detectielimiet waren in minder dan 1% van de monsters. Er was een sterke multicollineariteit zichtbaar voor de 20 gedetecteerde mediatorniveaus, zoals geïllustreerd door een heatmap.
Bij asymptomatische pasgeborenen geïnfecteerd met picornavirus, werd een opgereguleerd profiel waargenomen, voornamelijk bestaande uit type 1 immuunmediatoren, wat suggereert een immuunactiverende rol van koloniserende bacteriën en virussen in het vroegste deel van het leven. Er werd ook een associatie vastgesteld tussen de aanwezigheid van broers en zussen in het huishouden bij de geboorte en een specifieke Type 1 Type 17 gerichte mucosale immuunrespons, met bewijs voor correlatie van dit fenomeen met een in utero immuunprime-effect dat omgekeerd gecorreleerd is met de tijd sinds de laatste bevalling. Bovendien werden kinderen geboren van moeders die hoge versus placebo supplementen kregen gekenmerkt door een opregulatie van specifieke immuunmediatoren, wat suggereert dat Vitamine D een antibacteriële immuunrespons bevordert onafhankelijk van die geïnduceerd door virus, bacteriën, broers en zussen of maternale atopie.
Deze methode van microbemonstering kan ook worden gebruikt via een bronchoscoop, waardoor het mogelijk wordt om de immuunmediatoren in de lagere luchtwegen te bestuderen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mediatoren kunt meten in de niet-gestimuleerde luchtwegmucosa in vivo bij pasgeborenen en oudere kinderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een niet-invasieve techniek voor het bemonsteren van ongestoord slijmvliesvloeistof uit de bovenste luchtwegen. Hiermee kunnen in vivo-niveaus van eiwitmediatoren, zoals cytokinen en chemokinen, worden gekwantificeerd bij proefpersonen van alle leeftijden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Respiratoire aandoeningen
- Immunologie
- Pediatrie
Achtergrond
- Deze methode bestudeert de lokale immuunhandtekening van de luchtwegen zonder stimuleringsprocedures.
- Het is toepasbaar op pediatrische ademhalingsziekten zoals infecties, astma en allergie.
- De techniek maakt het mogelijk om lage concentraties immuunmediatoren in ongestimuleerd luchtwegslijmvlies in vivo te meten.
- De demonstratie van de procedure wordt uitgevoerd door Dr. Wolsk.
Doel van de studie
- Om de immuunrespons in het slijmvlies van de luchtwegen te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in pediatrische respiratoire aandoeningen.
- Om niet-invasieve bemonsteringstechnieken voor onderzoek te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van slijmvliesvloeistof uit de bovenste luchtwegen.
- Gebruik van vezelige gehydroxyleerde polyesterfiltervellen voor monsterverzameling.
- Observatie van symptomen van luchtweginfectie bij pasgeborenen.
- Kwantificering van cytokinen en chemokinen in de verzamelde monsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle afname van slijmvliesvloeistof zonder invasieve procedures.
- Mogelijkheid om immuunmediatoren in vivo te meten.
- Inzichten in het immuunprofiel van pediatrische patiënten.
- Potentiële toepassingen bij het begrijpen van respiratoire aandoeningen.
Conclusies
- De niet-invasieve bemonsteringsmethode is effectief voor het bestuderen van de immuniteit van de luchtwegen.
- Deze techniek kan het onderzoek naar de respiratoire gezondheid bij kinderen verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op de bevindingen met betrekking tot immuunmediatoren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze niet-invasieve bemonsteringsmethode voor slijmvliesvloeistof maakt directe kwantificering van in vivo immuunmediatoren in het slijmvlies van de bovenste luchtwegen mogelijk zonder stimulatie, wat een fysiologisch relevante weergave geeft van de immuunactiviteit in de luchtwegen. De techniek ondersteunt immuunprofilering in de vroege levensfase en longitudinale monitoring, wat mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van respiratoire therapieën faciliteert door genetische en omgevingsblootstellingen te koppelen aan immuunfenotypen. De toepassing ervan bij neonatale en pediatrische cohorten biedt voorspellende waarde voor endotypering en het monitoren van ziekteprogressie, in het bijzonder in de context van astma, allergieën en infectieziekten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het meten van baseline- en geïnduceerde spiegels van immuunmediatoren in ongestimuleerd slijmvliesweefsel.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare, minimaal invasieve matrix voor functionele targetvalidatie in pediatrische populaties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door correlatie van mediatorprofielen met klinische fenotypen, zoals asymptomatische virale infectie en effecten van blootstelling via broers en zussen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert geëlueerde eiwitmonsters die compatibel zijn met hooggevoelige elektrochemiluminescentie-multiplex-arrays voor kwantitatieve immuunprofilering.
- Standaardisatie: Maakt gebruik van consistente absorptie- en elutieprotocollen voor filterpapier om een reproduceerbare terugwinning van analyten over verschillende proefpersonen en tijdstippen te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Aantoonbare haalbaarheid in grote neonatale cohorten (n=620), wat high-throughput screening-applicaties in epidemiologische en interventionele studies ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt longitudinale bemonstering mogelijk van de geboorte tot in de kindertijd, waarbij immuunsignaturen uit de vroege levensfase worden gekoppeld aan latere uitkomsten van luchtwegaandoeningen.
- Afstemming van biomarkers: Detecteert upregulatie van type 1 en type 17 immuunmediatoren bij asymptomatisch met picornavirus geïnfecteerde neonaten, wat wijst op bruikbaarheid bij het identificeren van immuunendotypen.
- Mechanische risicoreductie: Toont associaties aan tussen supplementatie van vitamine D bij de moeder en antibacteriële immuunresponsen, wat bijdraagt aan de prioritering van targets voor immunomodulerende interventies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fase van discovery biology doordat deze directe meting van immuunmediatoren in vivo mogelijk maakt, wat bijdraagt aan de selectie van targets en de verduidelijking van signaalpaden voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van immuunpadactivatie in slijmvliesweefsel zonder ex vivo manipulatie of stimulatie-artefacten.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde eluaten die geschikt zijn voor multiplex immunoassay-uitlezingen, wat vergelijkende analyses tussen behandelings- of blootstellingsgroepen vergemakkelijkt.
- Analytica: Genereert kwantitatieve mediatorniveaus die statistische beoordeling van collineariteit, activiteit van het immuunnetwerk en fenotype-associaties mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt neonatale immuunprofielen met respiratoire symptomen in de kindertijd en omgevingsblootstellingen, ter ondersteuning van risicogestratificeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vertegenwoordigt een platformcompatibele bemonsteringstechniek die toepasbaar is op diverse modellen van respiratoire aandoeningen en therapeutische modaliteiten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door endogene immuunactiviteit in de natuurlijke mucosale micro-omgeving vast te leggen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde procedures voor collectie, elutie en opslag, waardoor pre-analytische variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door immunomodulerende mechanismen te koppelen aan immuunsignaturen uit de vroege levensfase, wat het biologische risico in een laat stadium binnen respiratoire programma's vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van aangetoonde effecten op mucosale immuunpaden in relevante, longitudinale humane modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist training in de anatomie van de neonatale luchtwegen en een zachte bemonsteringstechniek om het comfort van de proefpersoon en de integriteit van het monster te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot ultrafiltratiebuisjes, plaatshakers en een infrastructuur voor elektrochemiluminescentie-immunoassay voor de detectie van analyten.
- Vereist gestandaardiseerde bufferbereiding met protease-remmers om degradatie van mediatoren tijdens de extractie te voorkomen.
- Vereist aanpassing van de bemonsteringsduur of filtergrootte wanneer dit wordt toegepast op oudere kinderen of alternatieve mucosale locaties.
- Beperkt door de abundantie van analyten, waarbij sommige mediatoren zich vaak onder de detectielimiet bevinden, wat optimalisatie van de assay-gevoeligheid voor targets met een lage expressie noodzakelijk maakt.
