Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

De algemene doelstellingen van deze isolatie- en differentiatieprotocollen zijn het verkrijgen van adipocyt-progenitorcellen uit perivasculair vetweefsel en het induceren van hun differentiatie tot mature adipocyten. Deze methode maakt de analyse mogelijk van specifieke en gedefinieerde populaties adipocyt-progenitorcellen uit perivasculair vetweefsel, met een minimale impact op hun morfologie, levensvatbaarheid en het vermogen om te prolifereren en te differentiëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een verhoogde isolatie van antigeen-presenterende cellen per gram vetweefsel mogelijk maakt in vergelijking met fluorescence-activated cell sorting.

Nadat is bevestigd dat er geen reactie is op de teenknijptest, wordt een verticale incisie in de middenlijn langs het bornben tot aan het perineale gebied van de rat gemaakt om de buikholte te bereiken. Leg de arteria mesenterica superior, de kleine mesenteriale weerstandsvaten en de aorta thoracica bloot en sever alle verbindingen met het mesenterium en de aorta. Verzamel het gonadaal vetweefsel en breng de geïsoleerde vetkussentjes over naar een nieuwe container met Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer, of KRBB-oplossing, aangevuld met 10 millimolar HEPES.

Breng de vaten over naar een petrischaal met KRBB-oplossing en plaats de schaal onder een dissectiemicroscoop. Verwijder het perivasculaire vetweefsel van de kleine mesenteriale resistentievaten en de aorta. Breng in een biosafety cabinet ongeveer 50 milligram weefsel over naar een 1,7 milliliter buisje met 1 milliliter collagenase type I-oplossing en snijd het weefsel in stukjes van 1 tot 3 millimeter.

Het is belangrijk om het vetweefsel voldoende fijn te hakken, zodat het collagenase het bindweefsel grondig kan infiltreren. Incubeer de fragmenten 1 uur lang bij 37 °C onder schudding. Filtreer het verteerde materiaal vervolgens opeenvolgend door individuele celzeven van 100 en 40 micron in een buis van 50 mL.

Verzamel het resulterende filtraat door centrifugatie en resuspendeer de pellet in 1 milliliter erythrocytenlysebuffer. Breng de celsuspensie over naar een nieuwe Microfuge-buis van 1,7 milliliter voor een incubatie van 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Verzamel vervolgens de cellen van de stromale vasculaire fractie met een tweede centrifugatie en resuspendeer de pellet in basaal medium voor de stromale vasculaire fractie voor het tellen.

Om de adipocytprogenitorcellen te isoleren via magnetisch geactiveerde cel sortering, worden de cellen opgevangen door centrifugatie en wordt het pellet geresuspendeerd in magnetisch geactiveerde cel sortering blokkeringsbuffer met een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter voor een incubatie van 20 minuten bij 4 °C. Het is essentieel dat alle stappen van de isolatie bij 4 °C worden uitgevoerd, en niet op ijs. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 30 minuten met 5 µL FITC-geconjugeerd muis anti-CD34.

Verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Incubeer de cellen vervolgens met 4 µL anti-FITC MicroBeads in 96 µL magnetische-geactiveerde cel-sorteerbuffer gedurende 5 minuten in het donker. Terwijl de cellen incuberen, plaatst u een multi-sort kolom in de magnetische separator met een afvalbuis van 5 mL onder de kolom.

Spoel de kolom met 500 µL magnetische-geactiveerde cel-sorteerbuffer en gooi het effluent en de afvalbuis weg. Plaats vervolgens een nieuwe buis onder de kolom en breng de cellen aan op de bovenkant van de kolom, waarbij de ongelabelde CD34-negatieve cellen worden opgevangen in de nieuwe opvangbuis. Wanneer alle cellen door de bovenkant van de kolom zijn gegaan, wordt de kolom 3 keer gewassen met 500 µL ontgaste magnetische-geactiveerde cel-sorteerbuffer, waarbij het eluaat in de opvangbuis wordt verzameld.

Na de laatste wasbeurt wordt de kolom overgebracht naar een nieuwe opvangbuis. Gebruik de kolomplunjer om 1 milliliter magnetisch geactiveerde cel-sorteerbuffer door de kolom in de buis te spoelen, om de CD34-positieve cellen op te vangen. Verzamel de adipocyt-progenitorcellen door middel van centrifugatie. Incubeer vervolgens de CD34-positieve fractie gedurende 30 minuten in 10 microliters konijn anti-platelet-derived growth factor receptor alpha.

Centrifugeer de cellen aan het einde van de incubatie opnieuw en incubeer het pellet in 4 µL anti-rabbit IgG MicroBeads in 96 µL magnetic-activated cell sorting buffer voor de magnetische bead-isolatie van de platelet-derived growth factor receptor alpha-positieve cellen, zoals zojuist gedemonstreerd. Om de CD34-positieve platelet-derived growth factor receptor alpha-positieve adipocytprogenitoren te kweken, worden de cellen gezaaid in individuele 6-wells weefselkweekplaten met basaal medium en worden de platen geplaatst in een celkweekincubator op 37 °C en 5% CO2. Na 3 seriële passages worden de cellen gezaaid in zwarte 96-wells weefselkweekplaten met een dichtheid van 1 × 10² cellen per well; hun proliferatie wordt geëvalueerd na 8, 24, 48 en 96 uur bij 5 × 10⁴ cellen per well in 24-wells assayplaten, volgens standaardprotocollen voor proliferatieassays.

Om adipogenese te induceren, voedt u de cellen met basaal medium voor adipocyt-progenitorcellen gedurende 48 uur zodra de cultuur van adipocyt-progenitorcellen confluent is, en behandel de culturen vervolgens nog eens 48 uur met bone morphogenic protein 4. Vervang op de derde dag het medium gedurende 14 dagen door inductiemedium voor adipocyt-progenitorcellen, zonder IBMX en dexamethason. De mate van adipogenese in de culturen kan vervolgens worden beoordeeld bij 1 × 10⁴ cellen per putje in 48-well weefselkweekplaten, volgens standaardprotocollen voor adipogenese-assays.

Hoewel beide methoden een vergelijkbare celpopulatieverdeling en viabiliteit vertonen, levert isolatie via magnetisch geactiveerde cel sortering een groter aantal cellen op voor kweek vergeleken met fluorescentie-geactiveerde cel sortering. In dit representatieve experiment werd de in vitro proliferatie van via magnetisch geactiveerde cel sortering geïsoleerde stromale vasculaire fracties en adipocyt-progenitorcellen, geïsoleerd uit de thoracische aorta, kleine mesenteriale resistentievaten en gonadaal vetweefsel van mannelijke ratten, geëvalueerd op 8, 24, 48 en 96 uur na het uitplaten met behulp van een kwantitatieve DNA-assay. Er werden geen locatieverschillen in de expansiesnelheden van de stromale vasculaire fractie waargenomen op enig tijdstip, behalve voor de adipocyt-progenitorcellen uit de thoracische aorta, die na 96 uur minder proliferatie vertoonden vergeleken met stromale vasculaire cellen van dezelfde locatie.

Stimulatie van convergente adipocyt-progenitorcellen met bone morphogenic protein 4 gedurende 48 uur induceert adipocytdifferentiatie, wat wordt aangetoond door een grotere lipideaccumulatie in druppels, geëvalueerd via zowel een fluorescentie-assay voor lipideopname als Oil Red O-kleuring. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 8 uur worden voltooid, mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat een temperatuur van 4 °C wordt gehandhaafd tijdens de isolatiestappen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u adipocyt-progenitorcellen kunt isoleren en differentiëren.