Een Morfometrische en cellulaire analysemethode voor de lymfkliertest mandibulaire Condyle

Het algemene doel van dit experiment is om de effecten van compressieve belasting in het condylaire kaakkraakbeen van muizen te observeren met behulp van morfometrische metingen op röntgenfoto's en histologische analyse. Deze metingen kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de structurele en cellulaire veranderingen in de kaakgewrichtsknobbel van knaagdieren. Het grote voordeel van de hier getoonde techniek is dat ze kunnen worden gebruikt om andere kleine geboren of deelnemende dieren te analyseren.

Voor dit protocol, hebt u geïsoleerde, gedissekteerde muizenkaken klaar voor gebruik. Breng de kaken over op een petrischaal in een röntgenkastsysteem. Maak vervolgens röntgenfoto's bij 26 kilovolt gedurende vijf seconden.

Open nu de afbeeldingen in de analysesoftware om morfometrische metingen te maken. Gebruik eerst de unitknop om de schaalbalk in te stellen. Selecteer vervolgens zes anatomische punten met stijl marker 2.

Selecteer eerst de meest achterste punten van de kaakgewrichtsknobbel als punt een. Selecteer vervolgens het incisieproces voor punt twee. Selecteer dan het diepste punt bij de sigmoïdale inkeping voor punt drie.

Selecteer vervolgens het diepste punt in de concaviteit van de kaaktak, punt vier en selecteer dan het meest voorste punt van het gewrichtsoppervlak van de gewrichtsknobbel, punt vijf. Selecteer nu het meest achterste punt van het gewrichtsoppervlak van de gewrichtsknobbel als punt zes en ga verder met het nemen van lengtemetingen met behulp van het lengtegereedschap. Gebruik vervolgens het loodrechte lijngereedschap van punten drie naar vier om de lengte van het gewrichtshoofd te meten, wat de lengte van de loodrechte is, van punt een tot de lijn tussen punten drie en vier.

Meet vervolgens de kaaklengte, tussen punten een en twee. Meet tot slot de breedte van het gewrichtshoofd, die tussen punten vijf en zes ligt. Om de gegevens op te slaan, kopieert u de meetlijst aan de rechterkant van het scherm.

Voordat u de vaste, maar niet gedecalcifieerde kaken inbedt, laat u ze een nacht weken in 30 procent sucrose in PBS. De volgende dag, snijdt u overtollig zacht weefsel weg en snijdt u voorzichtig de kaakgewrichtsknobbel door. Plaats nu de monsters in plastic malletjes, met de mediale oppervlakte van de gewrichtsknobbel tegen de basis van de mal en het monster parallel aan de bodem van de mal.

Dompel ze vervolgens onder in beddende hars en koel de hars af met een stuk droogijs. Vul vervolgens de malletjes aan met meer beddende hars. Breng ze over in koude twee methylbutaan, gekoeld door een vriezer of door droogijs.

Zodra ze gekoeld zijn, bewaart u de monsters bij min 20 graden Celsius of bij min 80 graden Celsius voor het snijden. Om de expressie van Col10a1 in de MCC van sagittale secties van gewrichtsknobbels te kwantificeren, opent u de histologische afbeeldingen in een beeldanalysesoftwarepakket en selecteert u het gebied van belang met behulp van de lasso-tool. In dit geval wordt het MCC-gebied geselecteerd.

Let op het aantal pixels in het gebied, dat wordt weergegeven in het histogramvak. Selecteer vervolgens de rode Col10a1-pixels door de kleurenbereik aan te passen. Gebruik de oogdruppeltool om een rood pixel uit de afbeelding te selecteren en klik op OK. Noteer vervolgens het aantal rode pixels in het gebied, zoals weergegeven in het histogramvak.

Het aandeel rode pixels in het gebied vertegenwoordigt de hoeveelheid Col10a1-expressie. Kwantificeer vervolgens de TRAP-activiteit in de MCC en het subchondrale bot met behulp van dezelfde basistechniek. Selecteer eerst het kraakbeen in de subchondrale botgebieden als de te analyseren gebieden en let op het totale aantal pixels.

Selecteer vervolgens de gele pixels die worden gegenereerd door de ELF97-substraat. Let op het aantal positieve pixels en bereken het aandeel TRAP-positieve pixels. Kwantificeer nu de EDU-positieve cellen die tegen gekleurd zijn in blauw door DEPI.

Selecteer opnieuw het gebied van belang en kwantificeer vervolgens de blauwe pixels binnen dit gebied. Gebruik ook deze methode om het aantal EDU-positieve pixels in hetzelfde gebied te bepalen. Morfometrische metingen van muizen, onderworpen aan compressieve TMJ-belasting, toonden aan dat de belasting de lengte van de kaak en het gewrichtshoofd significant verhoogde.

De belasting resulteerde echter niet in een significante verandering in de breedte van het gewrichtshoofd. Kwantificering van de collageverdeling toonde een significante toename van Col10a1-expressie en de MCC van de gewrichtsknobbels van belaste dieren aan. Aan de andere kant was de expressie van Col2a1 niet veel verschillend van de controle.

De TRAP-activiteit nam toe in het subchondrale gebied van de gewrichtsknobbels en belaste muizen, evenals de subproliferatie. EDU-kleuring geeft het aantal proliferatieve cellen aan. De verdeling van proteoglycanen in de MCC werd gekwantificeerd door de toluidineblauw gekleurde gebied en de afstandskaart te evalueren.

Er was een significante toename in afstandkartering in de MCC van de gewrichtsknobbels van de belaste groep. De gebiedsafstand van proteoglycanen was echter statistisch niet verschillend tussen de groepen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de cellulaire en structurele veranderingen in de kaakgewrichtsknobbel van knaagdieren kunt analyseren.