Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten

Dit is het protocol voor de monstervoorbereiding voor de plasma-assay. Let op, om hun integriteit te waarborgen, moeten alle monsters en standaarden tijdens het verzamelen en verwerken op twee tot acht graden Celsius worden bewaard. Zodra de behandeling is voltooid, bewaar alle monsters op min 20 graden.

Voor de standaardvoorbereiding, bereid twee onafhankelijke stamoplossingen voor van elk anilidee, ivacaftor, M1 metaboliet, M6 metaboliet en lumacaftor in methanol op 100 microgram per milliliter en 10 microgram per milliliter. Let op, de verbindingen verlopen na 10 dagen op kamertemperatuur. Voor de standaarden, breng 100 microliter menselijk plasma over in de 1,5 milliliter polypropyleen microcentrifugebuizen.

Ga hiermee door voor al uw andere monsters. Voeg vervolgens de interne standaard toe aan elke buis. We kiezen bijvoorbeeld 0,01 microgram per milliliter van de bereide standaard.

Nu bevat deze buis plasma dat is verrijkt met de interne standaard. Ga zo verder met alle andere standaarden. Neem uw standaarden en centrifugeer deze een paar seconden om ervoor te zorgen dat alle vloeistof zich op de bodem van de buis bevindt.

Ga hiermee door voor al uw 40 standaarden. Voor de monsters van patiënten, breng 100 microliter van de monsterbuis over in de microcentrifugebuis. Het echte monsters van de patiënt wordt niet verrijkt met de interne standaard.

Centrifugeer het monsters van de patiënt een paar seconden om ervoor te zorgen dat alle vloeistof zich op de bodem van de buis bevindt. De volgende stappen zijn zowel ontworpen voor de monsters als voor de standaarden. Voeg 200 microliter van 0,1% formijnzuur in azetonitril toe aan elke monsterbuis om plasma-eiwitten te bezinken.

Ga hiermee door voor alle standaarden en monsters van patiënten. Vorm elke monsterbuis krachtig gedurende ongeveer 15 seconden. Ga hiermee door voor alle standaarden en aangedane monsters.

Laat 10 minuten in de koelkast staan om precipitatie te vergemakkelijken. Voor demonstratiedoeleinden zal ik slechts één monsters en één standaard centrifugeren. We centrifugeren 10 minuten op 10.000 rpm op een Eppendorf Centrifuge 5430 bij vier graden.

We zullen nu het supernatant filteren in de Phenomenex-vialen. Hiervoor gebruiken we een 13 millimeter spuitfilter met 0,45 micrometer nylon Grace-filters, gekocht in de VS, en we filteren in de HPLC-vialen die 1,5 milliliter kunnen bevatten. Na filtratie zullen we 100 microliter supernatant overbrengen in de LC/MS-vialen voor LC/MS-analyse.

Dit monsters is nu klaar voor analyse. Plaats nu eenvoudig al uw monsters in de monstershouder. We gebruiken een Shimadzu 8030 LC/MS-systeem, gekoppeld aan een triple-quadrupool massaspectrometer.

Laat het systeem gelijkmatig worden voordat u met de analyse begint. Zodra het gelijkmatig is, wat ongeveer 15 minuten duurt, drukt u op de Start-knop. Voor elke metaboliet, construeert u een kalibratiecurve door de piekoppervlakte-verhoudingen van aniliden uit te zetten tegen de nominale concentratie van kalibratiestandaarden.

Gebruik de regressie-vergelijking voor de kalibratiecurve om de concentraties van aniliden in het aangedane monsters te berekenen. Een typisch chromatogram wordt in deze figuur getoond. Geoptimaliseerde chromatografische resolutie werd verkregen met behulp van een mobiele fase van 100% azetonitril en 0,1% formijnzuur in water met een gradiënt elutie op een Phenomenex Kinetex C8-kolom.

De LC-retentietijden waren als volgt. Voor M6, één minuut. Voor M1, 1,3 minuten.

Voor ivacaftor, 1,55 minuten. Voor lumacaftor, 2,3 minuten. In alle blanco plasmamonsters werd geen interferentie waargenomen met de retentietijd van een van de aniliden, noch werd interferentie gedetecteerd van de combinatie van ivacaftor met lumacaftor.

Door de hoogdoorvoeranalyse van een grote hoeveelheid monsters van patiënten, hebben we onze gerapporteerde methode geoptimaliseerd door gebruik te maken van een kolom met kleinere poriëngrootte voor omgekeerde fasechromatografie Phenomenex C8 en een gradiënt-oplosmiddelsysteem in plaats van de huidige isocratische elutie. Dit verkort de looptijd tot zes minuten per monsters, inclusief de wasfase. Deze betrouwbare en nieuwe methode biedt een eenvoudige, gevoelige en snelle aanpak voor het therapeutisch geneesmiddelenmonitoring van ivacaftor en de combinatie ivacaftor-lumacaftor en biologische vloeistoffen.

Gezien de noodzaak om blootstellingsresponsrelaties te ontwikkelen om de geneesmiddelwerkzaamheid te maximaliseren en de zorgkosten te beperken, moeten er gevoeligere hulpmiddelen worden ontwikkeld en gevalideerd om clinici te helpen bij het gebruik van op bewijs gebaseerde therapie en hoogdoorvoer analytische technieken voor patiënten die lijden aan CF. Door de voorgestelde analytische methode toe te passen op klinische farmacokinetische en farmacodynamische studies, ontstaat de mogelijkheid om de farmacokinetische parameters van ivacaftor of de combinatie ivacaftor-lumacaftor op een grotere groep patiënten te onderzoeken.