Aanmaken en toepassen van een verwijzing ter vergemakkelijking van de discussie en de indeling van de eiwitten in een Diverse groep
16 augustus 2017
Het doel van dit protocol is het ontwikkelen van een verwijzing voor uiteenlopende eiwitten in een groep die ontbreekt aan coherente criteria voor nomenclatuur en classificatie. Deze referentie zal vergemakkelijken, analyses en discussie van de groep als geheel en kan worden gebruikt naast gevestigde namen.
Het algemene doel van deze procedure is om standaard spreadsheetsoftware te gebruiken om een referentie te ontwikkelen voor divergente eiwitten in een groep die geen coherente criteria voor nomenclatuur en classificatie heeft. Deze methode kan helpen bij het verduidelijken van relaties tussen verwante eiwitten met verwarrende of inconsistente nomenclatuur, zoals de cysteïne-gestabiliseerde alfa-bèta-superfamilie van verdedigingspeptiden die ongewervelde verdedigingen omvat. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige visuele weergave biedt van de eiwitten van belang.
Om te beginnen, identificeer de definiërende kenmerken van de eiwitgroep van belang. Bijvoorbeeld, de CS alfa-bèta vouwing in de oplossingsstructuur van insectenverdediging en hulp van phormia terraenovae definieert de CS alfa-bèta superfamilie. Deze vouwing omvat ook een kleiner motief genaamd de cysteïne-gestabiliseerde helix, dat wordt geïdentificeerd door CXXXC stroomopwaarts van een CXC.
De vier cysteïnes vormen twee disulfidebindingen. Om de CS alfa-bèta-motief te voltooien, wordt een derde disulfidebinding gevormd door een extra paar cysteïnes. Uiteindelijk is het van cruciaal belang om ten minste enkele belangrijke kenmerken te kennen die gerelateerd zijn aan de structuur of functie van het eiwit.
Zonder dit is er geen basis voor het genereren van een referentie. Voer nu deze definiërende kenmerken in een spreadsheet in. Gebruik kolommen voor de geconserveerde kenmerken en om de ruimtes tussen deze kenmerken weer te geven.
Houd de kolommen breed genoeg om nummers te passen en geef ze een consistente breedte. In de rijen beschrijf je de sequenties. Om een sequentie als kenmerk aan te geven, vul de kenmerkbox met kleur in, met behulp van de vulfunctie.
Vervolgens, om de ruimte tussen de kenmerken aan te geven, voer je het aantal aminozuren in het vak ertussen in. Voeg nu representatieve sequenties toe die eerder zijn vastgesteld als leden van de groep op basis van structurele databases en gepubliceerde resultaten. Voeg indien nodig kenmerken toe die waarschijnlijk een subgroep van sequenties zullen definiëren, zoals een extra cysteïne.
Als kenmerken ontbreken in een bepaalde sequentie, laat de box ongevuld en combineer deze met boxes die tussenliggende aminozuren vertegenwoordigen. Gebruik hiervoor de functie Samenvoegen en centreren. Zodra representatieve sequenties zijn ingevoerd, identificeer groepen van duidelijk verwante sequenties.
Vervolgens, vat de kenmerken van deze groepen samen. Wanneer het aantal aminozuren tussen kenmerken varieert, gebruik dan een streepje om een bereik aan te geven of slashes om een paar specifieke getallen aan te geven. Annoteer indien nodig creatief kenmerken die relevant kunnen zijn of niet vaak genoeg voorkomen om in de referentie op te nemen.
Bijvoorbeeld, omdat cysteïnes belangrijk zijn in de superfamilie, kan de aanwezigheid van extra cysteïnes worden gelabeld. Soms, wanneer nieuw geïdentificeerde sequenties aan de spreadsheet worden toegevoegd, vallen de sequenties van een soort in verschillende groepen van de superfamilie, zoals voor tardigraden. Eenmaal voltooid, kunnen de rijen van de spreadsheet worden gesorteerd om variatie binnen een soort of variatie tussen taxonomische groepen te benadrukken.
Deze demonstratie gebruikt de gratis beschikbare MEGA 6-software. Echter, andere software kan op dezelfde manier worden gebruikt. Om een nieuwe uitlijning te starten, selecteer Bewerken/Uitlijning bouwen onder het tabblad Uitlijnen.
Selecteer vervolgens Een nieuwe uitlijning maken, in het vak dat verschijnt en klik op OK. Selecteer vervolgens Eiwit. Selecteer nu Insert Sequence from File, in het Bewerken menu, om de sequenties te importeren. De sequenties moeten in FASTA-formaat zijn.
Achtergrondkleuren die verschillende aminozuurtypen weerspiegelen, worden standaard getoond en kunnen worden uitgeschakeld met een schakelaar, onder het menu Weergeven. Zodra alle sequenties zijn ingevoerd, klikt u op het buigzame armpictogram en vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen met behulp van het muscle-algoritme. Als de melding, Niets geselecteerd voor uitlijning.
Selecteer alles? verschijnt, kiest OK. Sommige parameters kunnen worden gewijzigd in het pop-upvenster, maar voor deze demonstratie zijn de standaardinstellingen voldoende. Controleer nu de uitlijning op basis van de belangrijke kenmerken van de eiwitsuperfamilie.
De bovenste balk toont een sterretje op elke positie waarin het aminozuur volledig behouden is. De initiële uitlijning identificeert drie van de vier geconserveerde cysteïnes. Eén sequentie is duidelijk verkeerd uitgelijnd.
Om een verkeerd uitgelijnde sequentie te herstellen, markeer de streepjes en druk op de Delete-toets zonder per ongeluk aminozuren te verwijderen. Beweeg vervolgens de aminozuren in hun juiste uitlijning door spaties toe te voegen. Na het handmatig uitlijnen van de sequentie, merkt u op dat het laatste cysteïne van het CXXXC-motief gedurende de hele uitlijning is behouden.
Handmatige aanpassing is vaak nodig om prioriteit te geven aan de belangrijkste kenmerken van de sequenties. De spreadsheet-uitlijning van de eerder vastgestelde CS alfa-bèta superfamilie onthulde vijf basispatronen van bindingsvorming. De nieuw geïdentificeerde tardigrade-sequenties vielen in het volledige spectrum van deze patronen.
Vervolgens werden fylogenetische analyses gebruikt om te onderzoeken hoe deze groep eiwitten zich mogelijk heeft ontwikkeld. De sequenties zijn echter over het algemeen kort en sterk gedivergeerd. Daarom waren de resulterende bomen slecht opgelost en boden ze weinig inzicht.
De meervoudige sequentie-uitlijning werd geoptimaliseerd met behulp van de referentie, maar er was nog steeds een slechte resolutie in de maximum-likelihood-analyse en in de Bayesiaanse fylogenetische analyse. De meeste clades hadden slechts een lage mate van ondersteuning. Er waren echter vijf kleine groepen ondersteund in ten minste een van de twee bomen.
Sequenties met verschillende cysteïne-nummers binnen een taxonomische groep kunnen nauwer verwant zijn dan sequenties met hetzelfde patroon uit verschillende groepen. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe spreadsheetsoftware te gebruiken om
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol heeft tot doel een referentiekader te creëren voor divergente eiwitten binnen een groep die momenteel geen coherente nomenclatuur en classificatiecriteria heeft. Door de relaties tussen verwante eiwitten te verduidelijken, zal dit referentiekader de discussies en analyses over deze groep verbeteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Eiwitclassificatie
- Biologische nomenclatuur
- Defensieve peptiden
Achtergrond
- De cysteine-gestabiliseerde alfa-beta superfamilie bevat diverse defensieve peptiden.
- Inconsistente nomenclatuur bemoeilijkt de studie van verwante eiwitten.
- Standaard spreadsheetsoftware kan worden gebruikt voor visuele representatie.
- Definiërende kenmerken helpen bij het identificeren van eiwitgroepen.
Doel van de studie
- Om een coherente referentie te ontwikkelen voor divergente eiwitten.
- Om een beter begrip en een betere communicatie over eiwitrelaties te faciliteren.
- Om te helpen bij de classificatie van eiwitten met een verwarrende nomenclatuur.
Gebruikte methoden
- Gebruik van standaard spreadsheetsoftware voor dataorganisatie.
- Identificatie van bepalende kenmerken van proteïnegroepen.
- Visuele weergave van proteïnen om relaties te verduidelijken.
- Focus op de cysteine-gestabiliseerde alpha-beta fold en geassocieerde motieven.
Belangrijkste resultaten
- Er is een duidelijk referentiekader voor divergente eiwitten vastgesteld.
- Relaties tussen eiwitten zijn visueel weergegeven.
- Verwarrende nomenclatuur is aangepakt via systematische classificatie.
- Er is inzicht verkregen in de cysteine-gestabiliseerde alpha-beta superfamilie.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol instrument voor eiwitclassificatie.
- Het vergroot het begrip van eiwitrelaties binnen de groep.
- Deze methode kan worden toegepast op andere eiwitfamilies die geen coherente nomenclatuur hebben.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Uitdagingen bij de eiwitclassificatie kunnen de doelwitvalidatie en vergelijkende analyses binnen ontdekkingsprogramma's belemmeren, vooral wanneer nomenclatuur en sequentiediversiteit functionele relaties vertroebelen. Het vaststellen van een referentiekader dat prioriteit geeft aan structurele en activiteitsgerelateerde kenmerken maakt een betrouwbaardere plaatsing van nieuwe sequenties mogelijk en ondersteunt cross-functionele R&D-discussies. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen en de besluitvorming over het portfolio voor eiwitfamilies met een hoge sequentiedivergentie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Verheldert functionele relaties tussen divergente eiwitten voor een robuuste targetvalidatie.
- Maakt systematische analyse van sequentie-activiteitsrelaties binnen eiwitsuperfamilies mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door geconserveerde structurele motieven die relevant zijn voor het mechanisme te highlighten.
- Faciliteert portfolio-triage door een coherent kader te bieden voor de integratie van nieuwe sequenties.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde referentiesets voor voor stroomafwaartse assay-ontwikkeling en screening-workflows.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door assays te koppelen aan geconserveerde sequentiekenmerken.
- Maakt schaalbare evaluatie van nieuwe sequenties mogelijk tegenover gevestigde structurele benchmarks.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van verbindingen door de context van sequentie-functie te verduidelijken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt sequentieclassificatie uit met ziekte-relevante structurele kenmerken wanneer dit van toepassing is.
- Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door consistente annotatie mogelijk te maken.
- Vermindert mechanische ambiguïteit in translationele studies met diverse eiwitfamilies.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door evolutionaire en functionele relaties te verduidelijken.
Integratie van pipeline en workflow
Deze referentiegebaseerde methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetidentificatie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor eiwitfamilies met een complexe sequentiediversiteit.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways mogelijk door geconserveerde kenmerken in divergerende sequenties in kaart te brengen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en reproduceerbaarheid door standaardisatie van sequentie-annotatie en alignment.
- Analyses: Levert kwantitatieve output voor het vergelijken van sequentiekenmerken en ter ondersteuning van statistische analyses.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de alignment van biomarkers en preklinische continuïteit wanneer structurele motieven ziekterelateerd zijn.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar classificatiekader dat aanpasbaar is aan nieuwe proteïnegroepen en evoluerende datasets.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij eiwitclassificatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert sequentie-annotatie, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen teams worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie mogelijk door sequentie-functierelaties te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de voortgang van eiwitgebaseerde ontdekkingsprogramma's.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in eiwitstructuur, sequentieanalyse en annotatie via spreadsheets.
- Toegang tot sequentiedatabanken, alignment-tools en visualisatiesoftware is noodzakelijk.
- Overeenstemming tussen teams over de prioritering van kenmerken en annotatiestandaarden is vereist.
- Aanpassing voor verschillende eiwitfamilies of taxonomische groepen kan noodzakelijk zijn.
- Handmatige curatie en iteratieve revisie zijn noodzakelijk om de nauwkeurigheid en relevantie van de referentie te behouden.
