Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten

Het algemene doel van deze procedure is om transcriptvervalpercentages in prolifererende en rustende fibroblasten te monitoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de moleculaire biologie, zoals of veranderingen in genexpressie het gevolg zijn van veranderingen in transcriptvervalpercentage. Het grote voordeel van deze techniek is dat het informatie geeft over het transcriptvervalpercentage, niet alleen de transcriptovervloed.

Om met het protocol te beginnen, moeten er prolifererende en rustende culturen van fibroblasten worden opgezet. Prolifererende fibroblasten moeten regelmatig worden getrypsiniseerd. Rustende culturen kunnen worden opgezet door platen te laten bereiken tot confluëntie met regelmatige mediumverversingen.

Voeg 150 microliter ActD toe aan voorverwarmd medium van 10 milliliter voor alle biologische replicaatcellencultuurplaten. Voeg ActD toe in een concentratie van 15 microgram per milliliter medium. Meng de oplossing goed.

Zuig het oude medium af en voeg medium met ActD toe aan de cellen. Om de nultijdsmonster te verzamelen, zuig voorzichtig het ActD-medium af en pipet tussen vijf en 10 milliliter voorverwarmde PBS op een 100-millimeter plaat, vijf milliliter oplossing voor een 100-millimeter plaat, twee milliliter voor een put van een zes-putsplaat en een milliliter voor een put van een 12-putsplaat. Zuig de PBS voorzichtig af.

Voeg vervolgens fenol-guanidine-isothiocyanaat oplossing rechtstreeks toe aan de weefselkweekplaat. Pipet de fenol-guanidine-isothiocyanaat oplossing cellenmix omlaag en omhoog meerdere keren om een homogene mix te maken. Verzamel elk tijdstip na het verstreken van de juiste hoeveelheid tijd, met behulp van de eerder beschreven methode.

Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten om de volledige oplossing van RNA-eiwitcomplexen te verzekeren. Introduceer vervolgens spike-in gecontroleerde transcripten die kunnen worden gedetecteerd met de gebruikte methodologie. Introduceer deze controles in elk monster met een bekende hoeveelheid en concentratie.

Gebruik een pipet om de fenylguanidine-isothiocyanaat oplossing mix naar een 2,0-milliliter microcentrifugebuis over te brengen. Voeg vervolgens 0,2 milliliter chloroform toe aan de fenylguanidine-isothiocyanaat oplossing mix voor elke één milliliter fenylguanidine-isothiocyanaat oplossing die is gebruikt. Schud de microcentrifugebuis krachtig gedurende 15 seconden en incubeer vervolgens de chloroform fenylguanidine-isothiocyanaat.

Na incubatie, centrifugeer de monsters bij 12.000 keer g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Het monster moet zich scheiden in drie lagen. Breng de waterige laag over naar een nieuwe 2,0-milliliter microcentrifugebuis met behulp van een micropipet en wees voorzichtig om de interfase tijdens dit proces niet te verstoren.

Gooi de interfase en organische fracties weg. Voeg vervolgens een gelijk volume van 2-Propanol toe aan de waterige fractie en draai de buis 10 keer om. Voeg tot een microliter van 20 milligram per milliliter waterige glycogeen toe per 20 microliters monster, vooral als de opbrengst verwacht wordt laag te zijn.

Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na incubatie, centrifugeer de monsters. Zorg ervoor dat aan het einde van de centrifugatie de RNA is geprecipiteerd om een witte pellet op de bodem van de buis te vormen.

Verwijder en gooi met een pipet het supernatant weg, wees voorzichtig om de witte RNA-pellet niet te verstoren. Voeg één milliliter van 75%ethanol toe per één milliliter fenylguanidine-isothiocyanaat oplossing reagens om de pellet te wassen. Centrifugeer de monsters bij 12.000 keer g gedurende 10 minuten.

Na het verwijderen van het grootste deel van het supernatant, gebruik een pipet om zoveel mogelijk ethanol te verwijderen maar verstoren de pellet niet. Centrifugeer de monsters om alle overtollige ethanol te pelleten. De RNA-pellet is minder compact in deze stap en heeft de neiging te bewegen.

Na de centrifugatie, verwijder al het overtollige ethanol uit de buis zonder de pellet te verstoren. Laat de RNA-pellet vijf minuten luchtdrogen. Voeg 50 microliters nuclease-vrij water toe aan de RNA-pellet en resuspendeer de pellet in nuclease-vrij water.

Behandel de monsters van één microliter Deanase om DNA te verwijderen en deactiveer vervolgens de Deanase en kationen. Bewaar de RNA-monsters in 2,0-milliliter microcentrifugebuisjes bij minus 80 graden Celsius. Kwantificeer de RNA en controleer de RNA op zuiverheid met behulp van een spectrofotometer.

Na het controleren van de zuiverheid, analyseer de RNA met een 1% agarose gel om de mate van degradatie te visualiseren. Twee heldere banden die 18S en 28S rRNA vertegenwoordigen, zouden duidelijk zichtbaar moeten zijn. Als deze banden niet zichtbaar zijn, kan de RNA gedegradeerd zijn.

Vervolgens, monitor de transcriptovervloed in de verzamelde aliquoten van RNA vergeleken met de toegevoegde interne standaard met behulp van Real-Time qPCR. Microarrays, RNA sequencing of northern blots kunnen ook worden gebruikt. Fluorescentie intensiteiten in de loop van de tijd komen overeen met genexpressie.

Terwijl fibroblasten contactgeremd worden, wordt het transcript dat codeert voor Collageen 3A1, een zeer belangrijk gen voor het creëren van de extracellulaire matrix die wordt afgezet tijdens wondgenezing, stabieler en vervalt niet zo snel. Vergeet niet dat werken met fenol uiterst gevaarlijk kan zijn en het is belangrijk om te voorkomen dat het je huid raakt. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je transcriptvervalpercentages in prolifererende en rustende fibroblasten kunt monitoren.

Veranderingen in transcriptvervalpercentage kunnen een belangrijk mechanisme van gen triangulatie zijn.