Methodologie voor Sputum inductie en laboratorium Processing
17 december 2017
Hier beschrijven we de techniek van sputum inductie. Dit protocol legt ook uit het sputum verwerking voor het uitvoeren van een telling van de differentiële cel en voor het verzamelen van sputum supernatant en cellen voor verdere analyse.
De techniek van geïnduceerd sputum is ontwikkeld in de vroege jaren 90. De techniek werd voorgesteld om nieuwe informatie te onderzoeken bij obstructieve luchtwegaandoeningen zoals astma, COPD, en recentelijk is er ook interesse geweest om nieuwe informatie te onderzoeken bij pulmonale fibrose. Het grote voordeel van deze techniek is dat het relatief niet-invasief is in tegenstelling tot bronchoscopie.
De verwerking vereist laboratoriumwerk en het duurt tijd, dus het is behoorlijk veeleisend, tijdrovend en er moet enige expertise zijn in het laboratorium, dus het is duidelijk een techniek die moeilijk te verkrijgen is in alle centra. De techniek van geïnduceerd sputum bestaat uit twee delen, het eerste deel is de inductie en het tweede deel is de verwerking. Voor het induceren van sputum moeten we een spirometrie uitvoeren, wat een beoordeling is van het volume en de stroomsnelheid die de patiënt kan produceren.
En dat moeten we doen omdat de sputuminductie op zichzelf bronquispasme kan veroorzaken, dus we moeten absoluut de basiswaarde van de spirometrie van de patiënten kennen. Dus we voeren eerst een spirometrie uit, dan geven we de patiënten bronchusverwijders, we geven meestal 400 microgram salbutamol, om de luchtwegen van de patiënten maximaal te openen en ook om een bronquispasme te voorkomen dat kan optreden tijdens de inductiefase. En na 15 minuten meten we de spirometrie opnieuw, om de zogenaamde basiswaarde van spirometrie te hebben, en in het bijzonder kijken we naar de FEV1, dat is het volume dat de patiënt binnen een seconde kan uitademen.
Giet gedistilleerd water in de kamer van de vernevelaar tot het aanbevolen niveau. Plaats een schone kom in de kamer van de vernevelaar. Bedek de gevulde dop met de juiste deksel.
Vul de kom met 50 ml hypertone zoutoplossing 5% als de post-bronchodilator FEV1 groter is dan 65% voorspeld, of 50 ml isotone zoutoplossing 9% als de post-bronchodilator FEV1 minder is dan 65% voorspeld. Voeg 1,75 salbutamolsulfaatoplossing toe met een concentratie van vijf milligram per ml aan de kom. Verbind de buizen en kleppen in overeenstemming met de instructies van de fabrikant.
De techniek moet worden uitgevoerd onder medische supervisie. Leg de patiënt het principe van de test uit. Vraag de patiënt om een neusklempje te gebruiken.
Start de vernevelaar en selecteer het laagste niveau van aerosol en ventilatorinstelling. Vraag de patiënt om de aerosol in te ademen via de mondstuk met normale ademhaling. Het niveau van aerosol en ventilatorinstelling kan worden verhoogd, afhankelijk van de tolerantie van de patiënt.
In geval van pijn op de borst of ademhalingsproblemen, stop de procedure en voer een spirometrie uit om de FEV1-waarde van de patiënt te meten. Na vijf minuten inademing, of in geval van hoesten of misselijkheid, stop de vernevelaar. Vraag de patiënt om de neusklempje te verwijderen, de mond te spoelen en twee keer met kraanwater te gorgelen, en dit water weg te gooien in de gootsteen.
Vraag de patiënt vervolgens om sputum op te hoesten en wat er uit de keel komt in een plastic bakje te spugen. Voer de eerste ademhalingsmanoeuvre uit om FEV1 te meten. Na elke poging tot sputumproductie meten we de FEV1-waarde.
Als de FEV1-waarde met meer dan 20% daalt, stoppen we de procedure en geven we de patiënten een verneving van ipratropiumbromide, een anticholinergicum dat in combinatie met bèta-twee-agonisten zal werken die we al tijdens de procedure hebben toegediend. Als de FEV1-waarde niet met meer dan 20% daalt, voeren we de procedure voort voor een totale tijd van 10 tot 20 minuten, afhankelijk van de kwaliteit en het volume van sputum dat de patiënt heeft geproduceerd. Zodra u de sputummonster heeft, bewaart u deze in de koelkast tot verwerking.
De tweede fase bestaat uit de verwerking van sputum en hiervoor moeten we eerst de twee oplossingen voorbereiden die we voor deze verwerking zullen gebruiken. Dus we moeten Dithiothreitol ook bekend als DTT voorbereiden. De oplossing moet worden bereid door DTT te verdunnen met steriel water om een 6,5 millimolair oplossing te verkrijgen.
U moet ervoor zorgen dat de DTT niet wordt blootgesteld aan omgevingslucht en hiervoor gebruiken we een spuit en naald. Ten tweede moet u de trypanblauwoplossing bereiden en hiervoor moet u een verdunning van DPBS met trypanblauw doen om een oplossing van 0,08% te verkrijgen. Wat betreft het sputum, moet u het hele sputum overbrengen in een 50 mL conische bodemplastic buis en de monster wiegen. Voeg een drievoud gewicht van DPBS-oplossing toe.
Meng het monster langzaam gedurende 30 seconden, centrifugeer bij 800 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant in een 50 mL conische bodemplastic buis, na filtratie door twee enkele lagen steriele gaas. Verdeel de supernatant in 2 mL plastic buisjes en bewaar bij min 80 graden Celsius.
Merk op dat de supernatantmonsters voor ons nuttig zijn als driefasige component van sputum. Als het volume van de celpallet minder is dan 5 mL, voeg dan DPBS toe om een volume van 5 mL celsuspensie te bereiken. Verdun de celsuspensie met één volume DTT bij 6,5 millimolair.
Schud de celsuspensie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een laboratoriumassistent. Verdun de celsuspensie minstens driemaal met DPBS. Centrifugeer de verdunde celsuspensie bij 550 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Gooi de supernatant weg. Suspensie de celpalette in ongeveer een ml DPBS. Beoordeel en noteer het exacte volume van de celsuspensie.
Voeg 50 microliter celsuspensie toe aan 50 microliter van de verdunde trypanblauwoplossing en homogeniseer. Plaats het monster onder de deksel van een hemocil cytometer en plaats het onder een optische microscoop. Beoordeel de celconcentratie van de celsuspensie, het percentage van de plaveiselc
Overzicht
Dit artikel beschrijft de techniek van sputuminductie, een niet-invasieve methode die wordt gebruikt om sputummonsters te verzamelen voor analyse bij respiratoire aandoeningen. Het protocol bevat gedetailleerde stappen voor de verwerking van sputum om differentiële celtellingen uit te voeren en supernatant te verzamelen voor verder onderzoek.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Respiratoire Geneeskunde
- Klinische Technieken
- Celanalyse
Achtergrond
- Techniek voor geïnduceerd sputum ontwikkeld aan het begin van de jaren 90.
- Gebruikt voor het onderzoek naar obstructieve luchtwegaandoeningen zoals astma en COPD.
- Recente interesse in longfibrose.
- Niet-invasief alternatief voor bronchoscopie.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor sputuminductie en -verwerking.
- Om de verzameling van sputummonsters voor cellulaire analyse te faciliteren.
- Om het begrip van respiratoire aandoeningen via sputumanalyse te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voer spirometrie uit om de basislongfunctie te beoordelen.
- Dien bronchodilatoren toe om bronchospasmen tijdens de inductie te voorkomen.
- Induceer sputum met behulp van hypertoon zoutoplossing en verneveling.
- Verwerk sputummonsters voor differentiële celtellingen en het verzamelen van het supernatant.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle afname van sputummonsters voor analyse.
- Gedetailleerde methodologie voor de verwerking van sputum beschreven.
- Beoordeling van de celviabiliteit en concentratie gerealiseerd.
Conclusies
- De techniek voor sputuminductie is effectief voor niet-invasieve monsterafname.
- Een correcte verwerking van het sputum is cruciaal voor een nauwkeurige analyse.
- Dit protocol kan ondersteuning bieden bij onderzoek en klinische diagnostiek van respiratoire aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Sputuminductie en -verwerking bieden een niet-invasieve methode voor het verzamelen van luchtwegcellen en supernatant, waardoor mechanistische studies naar inflammatoire pathways bij respiratoire aandoeningen mogelijk worden. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door kwantitatieve cellulaire en biochemische gegevens uit de longmicro-omgeving te leveren, wat cruciaal is voor het verminderen van risico's bij hypothesen in onderzoek naar astma, COPD en fibrose. De techniek vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door klinische monsteranalyse te verbinden met functionele targetinterrogatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door immuuncelpopulaties (neutrofielen, eosinofielen, macrofagen, lymfocyten, epitheelcellen) in het lumen van de luchtwegen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare differentiële celtellingen en levensvatbaarheidsbeoordelingen via gestandaardiseerde methoden met een hemocytometer en trypaanblauw-exclusie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door analyse van sputumsupernatans op mediatoren en cellulaire componenten voor flowcytometrie, genomica of proteomica.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Operationele waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen (celсусpensie en supernatant) voor op downstream-assays met gedefinieerde verwerkingsstappen, inclusief DTT-mucolyse en centrifugatie.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve output zoals celconcentratie (doel: 500.000 cellen/mL) en viabiliteitspercentage, wat standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Faciliteert de gereedheid voor screening door opslag van supernatant bij -80°C voor biomarkeranalyse en het gebruik van een celconcentrator voor de preparatie van objectglazen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt ontdekking met preklinische continuïteit door het analyseren van inflammatoire celprofielen in ziekterelevante systemen (astma, COPD, longfibrose).
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang via kwaliteitscontrole-drempels (bijv. <80% plaveiselcellen) om de geschiktheid van monsters voor cytospin en verdere analyse te garanderen.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de afstemming van translationele biomarkers door het mogelijk maken van de meting van biochemische markers in het supernatant en cellulaire fenotypen die gekoppeld zijn aan ziektemechanismen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, ter ondersteuning van de analyse van luchtwegontstekingen en de biomarker-gestuurde prioritering van targets in programma's voor respiratoire ziekten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door het kwantificeren van celtypen en mediatoren in geïnduceerd sputum, wat de ontstekingsstatus van de luchtwegen weerspiegelt.
- Screening: Waarborgt de gereedheid van de assay via gestandaardiseerde verwerking: DTT-verdunning (6.5 mM), trypaanblauw-kleuring (0.08%), centrifugatie (800 g en 550 g) en aanpassing van de celconcentratie naar 500,000 cells/mL.
- Analytics: Maakt vergelijkende analyse mogelijk via differentieel cel tellen (neutrofielen, eosinofielen, etc.), levensvatbaarheidsbeoordeling en het verzamelen van supernatant voor de meting van biochemische markers.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via ziekterelevante celprofilering bij astma, COPD en fibrose, ter ondersteuning van biomarker-afstemming en mechanismevalidatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor longitudinale monitoring van ontstekingen en targetvalidatie bij diverse respiratoire indicaties via gestandaardiseerde sputuminductie en -verwerking.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door kwantitatieve inflammatoire profilering en vermindering van mechanistische ambiguïteit in modellen van luchtwegaandoeningen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gedefinieerde reagensconcentraties (DTT 6.5 mM, trypaanblauw 0.08%), centrifugeringsparameters en doelen voor celconcentratie.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door het vroegtijdig leveren van mens-relevante inflammatoire gegevens via niet-invasieve bemonstering.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van reproduceerbare celdifferentiaties en biomarkerniveaus in het supernatant die duiden op target-engagement of padmodulatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in respiratoire fysiologie, celbehandeling en microscopische analyse voor accurate spirometrie, monitoring van de inductie en celtelling.
- Vereist nebulisatieapparatuur, centrifuge (800 g en 550 g), hemocytometer, cytocentrifuge en opslag bij -80°C voor het behoud van het supernatant.
- Vereist standaardisatie van verwerkingsstappen tussen teams: DTT-bereiding waarbij blootstelling aan lucht wordt vermeden, verdunning van trypaanblauw, selectie van zoutoplossing op basis van de FEV1 na bronchodilatatie en getimede mucolyse (20 min schudden).
- Omvat overwegingen voor aanpassing: toniciteit van de zoutoplossing (5% hypertoon of 9% isotoon) aangepast aan de FEV1 van de patiënt, en aanpassingen in de verwerking als het volume van de celpellet <5 mL is (suppletie met DPBS).
- Omvat praktische beperkingen: technische eisen, tijdsintensiviteit, noodzaak van medisch toezicht en uitsluiting van monsters als plaveiselcellen >80% zijn, wat duidt op orale contaminatie.
