Een eenvoudige en goedkope Assay voor het meten van Ambulation in muismodellen van spierdystrofie
29 december 2017
Dit protocol beschrijft een flexibele, voordelige systeem voor het meten van de muis ambulation in een open veld activiteit assay. We laten zien dat een bepaling van de 6 minuten durende ambulation op basis van dit systeem een afname van de vrijwillige beweging in mdx muizen detecteert en nauwkeurig verbetering in een spier-specifieke redding van deze dieren onderscheidt.
Het algemene doel van deze assay is het meten van vrijwillige ambulatie in muismodellen voor spierdystrofie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van spierdystrofie over de progressie van spierzwakte in muismodellen voor spierdystrofie en de effectiviteit van potentiële therapeutica. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een niet-invasieve en reproduceerbare meting van de activiteit van het dier biedt die eenvoudig kan worden aangepast aan veel verschillende onderzoekssituaties.
Plaats in een rustige, temperatuurgecontroleerde ruimte op een vast tijdstip van de dag een camera op een gaasnet boven de activiteitskamer om opname van de gehele arena mogelijk te maken en reinig de kamer met desinfectiemiddel. Laat de muis vlak voor de activiteitsmeting de poolstang van een digitale krachtmeter vastgrijpen en trek deze voorzichtig naar achteren tot de poolstang wordt losgelaten. Registreer de piekspanning in Newtons voor elke trial.
Met één minuut rust tussen de trials. Plaats de muis direct na de grijpkrachtmeting in de kamer en start de video-opname, waarbij de muis vrij mag verkennen. Stop de opname na zes minuten en plaats de muis terug in de thuiskooi.
Open voor de trackinganalyse van de videogegevens eerst de opname in de geschikte videobewerkingssoftware en stel de snelheid in op twee keer. Exporteer de gedecimeerde video in mp4-bestandsformaat voor de trackinganalyse en open de video in het geschikte videoanalyseprogramma. Gebruik om de kalibratie voor de video-opname in te stellen de lijngereedschap om een lijn langs één zijde van de kamer te trekken.
Klik met de rechtermuisknop op de lijn, selecteer 'calibrate measure' en voer de werkelijke afmeting van de zijwand van de kamer in centimeters in. Klik op de cursor voor verplaatsing om te beginnen met de semi-automatische tracking van de positie van de muis. Klik met de rechtermuisknop op het punt dat gevolgd moet worden, beginnend bij het eerste frame van de video.
Het trackingpunt wordt aangegeven met een blauwe cirkel. Gebruik de rechterpijltoets op het toetsenbord om naar het volgende frame te gaan. Het trackingpunt zou automatisch moeten verschuiven op basis van de positie van de staartbasis.
Als de trackingpositie in een bepaald frame niet is uitgelijnd met het punt van interesse, lijn dan de blauwe cirkel handmatig uit met de trackingpositie. Wanneer de gehele video is gevolgd, sla dan de video en de tracing-overlay op en selecteer 'export naar spreadsheet' om de positionele gegevens van de tracing te exporteren. In overeenstemming met de resultaten uit soortgelijke assays vertonen dystrophine-deficiënte mdx-muizen die vlak voor de test aan een trainingsprotocol zijn blootgesteld, significant minder vrijwillige beweging in een openveldtest van zes minuten dan wildtype dieren.
Inderdaad, na de lichte inspanning van een grijpkrachttest bleven de mdx-muizen doorgaans stil tijdens de eerste minuten van het ambulatieprotocol, met een bescheiden toename in beweging tussen minuut vier en vijf. Wanneer wild-type en mdx-dieren zonder oefenuitdaging echter worden vergeleken, worden er geen verschillen in de afgelegde afstand vastgesteld. Mdx-muizen die transgeen zijn voor utrofine-expressie zijn niet te onderscheiden van wild-type dieren, zonder significante verschillen in de totale afgelegde afstand of op enig van de waargenomen cumulatieve tijdstippen.
Om het effect van het verlagen van de bemonsteringsfrequentie te bepalen, werd de totale afgelegde afstand uit één minuut video met volledige framerate gemeten en vergeleken met de afstandmetingen afgeleid van gedownsamplende versies van de dataset. Het halveren van de framerate leidde tot een afname van de gemeten afstand met 5% ten opzichte van de oorspronkelijk berekende afstand. De nauwkeurigheid van de gemeten afstand neemt na dit punt scherp af, hoewel zelfs sterk gedecimeerde datasets het pad van het dier nog steeds nauwkeurig benaderen; dit onderstreept het belang van het meewegen van de framerate en signaalverwerking bij het beoordelen van dierlijke activiteit, en demonstreert dat een hoge ruimtelijke resolutie behouden kan blijven in gedownsamplende videodata.
Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u de locomotie van muizen in een open veld-omgeving kunt registreren en analyseren. Eenmaal beheerst, kan deze analyse in 15 tot 30 minuten worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Deze goedkope en niet-invasieve assay stelt onderzoekers in staat om de motorische activiteit in muismodellen voor spierdistrofie te onderzoeken en kan dienen als een informatieve eerste stap voor verdere functionele metingen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een flexibel, kostenefficiënt systeem voor het meten van de voortbeweging van muizen in een open field activiteitstest. De methode biedt een niet-invasieve en reproduceerbare meting van de dierlijke activiteit, die kan worden aangepast aan diverse onderzoeksettings.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Onderzoek naar spierdystrofie
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- De assay meet de vrijwillige voortbeweging in muismodellen voor spierdistrofie.
- Het beantwoordt kernvragen over de progressie van spierzwakte.
- De techniek is ontworpen om de effectiviteit van potentiële therapeutische middelen te evalueren.
- De registratie vindt plaats in een gecontroleerde omgeving om consistentie te waarborgen.
Doel van de studie
- Om vrijwillige beweging bij mdx-muizen te meten.
- Om de impact van spierspecifieke interventies te beoordelen.
- Om inzicht te verschaffen in de progressie van spierdystrofie.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een camera boven de activiteitskamer voor registratie.
- Het reinigen van de kamer met desinfectiemiddel voor de proeven.
- Het toestaan dat de muis zich aan een staaf vastklampte om de piekspanning te meten.
- Het registreren van de activiteit tijdens een ambulatie-assay van 6 minuten.
Belangrijkste resultaten
- Het systeem detecteert afnames in de vrijwillige beweging bij mdx-muizen.
- Het maakt nauwkeurig onderscheid tussen verbeteringen als gevolg van spierspecifieke redding.
- De resultaten zijn reproduceerbaar over verschillende proeven heen.
- De methode is aanpasbaar aan diverse onderzoekssituaties.
Conclusies
- Deze assay is effectief voor het bestuderen van spierdystrofie bij muizen.
- Het biedt waardevolle gegevens over de effectiviteit van potentiële behandelingen.
- De aanpak is flexibel en kan in diverse onderzoeksomgevingen worden toegepast.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het meten van vrijwillige ambulatie in muismodellen biedt een translationele uitkomstmaat voor de motorische functie bij spierdystrofie, wat direct analoog is aan klinische eindpunten zoals de 6-minutenwandeltest. Deze kostenefficiënte, videogebaseerde assay maakt een reproduceerbare, niet-invasieve beoordeling van de ziekteprogressie en therapeutische respons in preklinische studies mogelijk. Door activiteitsdeficiënties in dystrophine-deficiënte mdx-muizen en herstel via utrophine-expressie te detecteren, ondersteunt deze methode doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van neuromusculaire geneesmiddelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door vrijwillige ambulatie te kwantificeren als een functionele readout van spierkracht in dystrofische modellen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door middel van reproduceerbare genotype-fenotypecorrelatie in mdx-muizen versus wild-type en gerescued cohorten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door effectieve interventies te onderscheiden (bijv. utrofine-transgeen) die activiteitsniveaus normaliseren tot wild-type.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening met behulp van gestandaardiseerde open-field ambulatiemetrieken.
- Reproduceerbaarheid: Levert kwantitatieve resultaten op basis van afstand en tijd die zich lenen voor assay-standaardisatie tussen laboratoria.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van gratis open-source software en toegankelijke hardware om hergebruik van het platform in diverse onderzoeksomgevingen mogelijk te maken zonder gespecialiseerde apparatuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Modelleert patiëntrelevante loopdeficiënties, waardoor translationele continuïteit wordt geboden van ontdekking tot preklinische validatie.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen effecten voortkomen uit spierspecifiek herstel versus aspecifieke veranderingen in de activiteit.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria door het herstel van het loopvermogen te correleren met target-engagement en pathway-modulatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-identificatie en biedt een functionele brug tussen moleculaire mechanismen en fenotypische uitkomsten in modellen voor spierdystrofie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door genetische of farmacologische interventies te koppelen aan meetbare veranderingen in vrijwillige beweging.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via reproduceerbare, videogebaseerde tracking die kwantificeerbare loop-eindpunten genereert voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert positionele en temporele datastromen waarmee teams de locomotorische activiteit kunnen vergelijken tussen genotypen, behandelingen en tijdspunten.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door klinische beoordelingen van de loopfunctie te spiegelen, wat de afstemming van biomarkers en voorspellende modellering faciliteert.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare, kosteneffectieve capaciteit voor looptesten die de afhankelijkheid van gespecialiseerde kernfaciliteiten vermindert.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in assays voor motorische functies te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via open-source tracking en gecontroleerde omgevingscondities.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de behoefte aan dure motion-tracking systemen te elimineren, terwijl de datakwaliteit behouden blijft.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van functioneel herstel van ambulatie-fenotypes in preklinische modellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist basisexpertise in videopresentatie en opensource trackingsoftware (bijv. handmatige uitlijning frame voor frame).
- Is afhankelijk van standaard beeldvormingsapparatuur en consistente omgevingscontroles (verlichting, temperatuur, tijdstip van de dag).
- Vereist strikte naleving van het protocol door alle teams om reproduceerbaarheid tussen locaties en operators te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende kamergroottes, muizenstammen en activiteitsniveaus.
- Houdt rekening met compromissen tussen framerate en meetnauwkeurigheid, aangezien downsampling de precisie van de afstandsberekening vermindert.
